冬枣果实中多聚乳糖醛酸酶的纯化及部分性质分析.pdf

摘要 果实成熟软化过程中细胞壁水解酶活性升高，细胞壁结构被破 坏，细胞内含物减少。经研究，这些细胞壁酶中，多聚半乳糖醛酸 酶(PC,)是枣果实成熟软化的关键酶。为了证明PG在这一作用中的机 理、筛选PG的活性抑制剂、开展控制软化转基因工程的研究，j本试 验以鲜食枣品种冬枣为材料，对PG进行纯化和部分性质分析。 首先，本研究就缓冲液类型、抽提时间、缓冲液中盐浓度以及pH 值等对PG抽提活性的影响进行了探索。借果表明，当缓冲液中盐浓 度增加到1．8mol·L。时，PG抽提活性仍很升高，说明高浓度的盐有 利于冬枣果实中PG的抽提。 层析条件研究结果表明，f当样品pH值低于4．5时，冬枣果实中 CL PG不能有效吸附到CM—Sepharose6B阳离子交换层析柱上，当 样品pH值高于6．0时，PG能吸附到该层析柱上，且洗脱活性逐渐降 低，pH值5．5时，吸附和洗脱效果均很好。另外，pH值梯度洗脱 过程中，样品活性损失较多；而离子梯度洗脱蛋白分离效果好，同 时回收率高，因此J离子梯度洗脱适合于冬枣果实中PG的纯化。 G-75凝胶过滤层析洗脱过程中．对样品上样量和 在Sephadex 洗脱流速进行探索，结果使样品与杂蛋白达到基线分类。 经过上述研究建立了冬枣果实中PG的纯化程序。『主要包括如下 步骤： CL 1．分步抽提PG蛋白。2．通过CM—Sepharose6B阳离子交换柱。 G-75凝胶过滤层析柱。经过上述步骤，纯化了枣 3．通过Sephadex 果实中多聚半乳糖醛酸酶，聚丙烯酰胺电泳检测，呈现一条蛋白带。 性质分析结果表明：冬枣果实中PG的最适pH值为4．7；最适反 应温度为45℃；在不同温度条件下，PG的稳定性差异很大，40C保 温l小时，其活性剩余79．6％；60。C保温l小时，其活性几乎全部丧 失。以多聚半乳糖醛酸为底物，37℃、pH值5．5条件下反应，冬枣 果实中PG的Km值为1．4mg·ml～。卜一， 关键词：枣果实 多聚半乳糖醛酸酶 纯化 性质分析 缩写词目录 缩写符号 英文名 中文名 PG· polygalacturonase 多聚半乳糖醛酸酶 Endo．PG 内切多聚半乳糖醛酸酶 endo．polygalacturonase Exo．PG 外切多聚半乳糖醛酸酶 exo．polygalacturonase PME 果胶甲酯酶 pectinmethylesterase B．Gal B—galactosidase B一半乳糖苷酶 PoD peroxidase 过氧化物酶 DTT dithiothreitol 二硫苏糖醇 PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳 gelelectrophoresis polyacrylamide PEG glycol 聚乙二醇 polyethylene