催化合成茶氨酸菌株筛选与重组菌的构建.pdf

摘 要 茶氨酸(Theanine)是1950年首次从绿茶中分离得到的，是茶叶中的特征氨基酸，也是茶叶 的呈味物质之一，具有很好的生理功能和商业价值。其制各研究是目前茶学研究中的一个热点。 由于从茶叶中提取高纯度的茶氨酸，成本高昂；化学合成茶氨酸工艺较复杂；组织培养合成茶氢 酸产量低。开展茶氨酸的生物合成研究具有重要的理论意义和实践价值。本论文针对茶氨酸的微 生物发酵法制备技术，开展了菌株筛选和工程菌构建两方面工作，将生物技术运用到天然产物制 各技术中。本论文通过比较不同微生物催化L一谷氨酰胺(L吒ln)和盐酸乙胺合成茶氨酸的能力 大小，对微生物进行了筛选，明确了9种微生物催化合成茶氨酸的能力；通过基因克隆技术构建 了重组菌，优化了重组菌催化合成茶氨酸的条件，重组菌株酶活达到出发菌株的15倍，茶氨酸产 量达到29．409／L。主要研究结果如下： 1、对9种微生物催化L一谷氨酰胺和盐酸乙胺合成茶氨酸的能力进行了测试，发现它们催化 合成茶氨酸的能力都很低。茶氨酸的最大生成量仅为7．9llIg／L。 cojIDH5n(EcojjDH5 2、以培养好的西曲e订c州a n)菌液为模板进行PcR反应，将扩 增出的y一谷氨酰转肽酶基因片断和载体pET-32a相连接构建重组质粒pET_G6T，将重组质粒 cojj pET-GGT转化至E 结果显示出明显的特征蛋白质条带。经酶活性检测，重组菌株每克湿菌体的酶活达到2．0u／Ⅲ1左 DH5 右，约是出发菌株Ecojj a的15倍。 3、本实验优化了重组菌催化L一谷氨酰胺和盐酸乙胺合成茶氨酸的反应条件，重组菌经37℃ L 一谷氨酰胺、2．叫盐酸乙胺、70mg／m1菌体、pH9．5)于30℃培养4小时。茶氨酸的最大生成量 等报道的用构建的重组菌催化谷氨酰胺(Gln)和乙胺合成茶氨酸的量为2o．909几，G1n转化率为 60％。本实验中的L-G1n转化率稍低，但是茶氨酸产量有所提高。 本实验构建的重组菌具有较好的催化L一谷氨酰胺和盐酸乙胺合成茶氨酸的能力，可以尝试 用其进行发酵生产茶氨酸小试实验，可以尝试将本实验构建的重组质粒转化到不同表达载体系统 中，以寻找更适合Y珞氨酰转肽酶大量表达的载体系统。本实验对于微生物发酵法工业化生产茶 氨酸等方面的工作具有较好的指导作用和实际价值。 关键词：筛选，茶氨酸，Y一谷氨酰转肽酶，重组菌，催化合成 Abstract TheaIline，whichwasfirst teain1950，isnot memainfhe蜘inoacid separated行Omgreen only of me umarlli tea．n a11d oftea，butalso major highphysiolo西cal component componentpossesses medicalbenefits．The oftlleallineisarese甜chhot Itis dimcult柚dmore prep鼬tion point．thatVery to a tealeaves．Thetechnicsof ex呲I chemosyn(hesis expe岫ive hi曲”r时the锄inedirectly疗om meall．meis of也e锄ine cultIlreislow．so，廿1e ofthe柚ine complicaced：Theyield by廿ss