乳酸乳球菌中冷激蛋白的表达及其抗冻保护作用.pdf

摘要 乳酸菌在食品工业中扮演者重要角色，参与许多个发酵过程。作为牛乳中检出率最高的 菌——乳酸乳球菌(1,．1actis subsp．1actis)，有较强的产酸力及蛋白质分解能力，对多种链球 菌、葡萄球菌、芽孢菌、乳杆菌有抑制作用。在干酪、发酵奶油、奶酪的发酵剂中经常使用。 因此对其发酵后冷却及冷冻保藏过程中的存活率的研究至关重要。目前，国内有很多机构和 学者是从研究保护剂等外部条件的保护作用的角度出发，而对乳酸菌自身抵抗环境变化的保 护机制研究较少。 ． 有一明显现象大多数微生物(包括乳酸菌)都能适应比其最佳生长温度低得多的低温环 境，诱导产生一系列分子质量7kDa左右的蛋白质，这一系列蛋白质被称为冷应激蛋白，它 们一般由68到74个氨基酸构成，都存在5个反平行13折叠股的B桶状片层结构。它们的主 要功能是作为RNA分子伴_fg(RNA 促进翻译。 本课题主要针对乳酸乳球菌中冷应激蛋白。研究了不同冷处理条件下冷诱导蛋白产生及 对菌体抗冻特性的影响，并通过NICE系统高效表达冷应激蛋白Cspc、CspD基因，进一步 证实了csPs的作用。课题主要分为以下几部分： 分别为：28℃～13℃之间和小于13℃。 2．10℃保持4h的冷处理．使菌体冻融存活率较未处理的空白样增加了200倍以上，而加入 氯霉素的对照组存活率接近于或低于未处理的空白样。初步推断可能是氯霉素抑制了某种蛋 白合成，而这种新合成的蛋自在低温条件下被诱导表达，保护细胞，使菌体获得抗冻特性。 3．通过SDS—PAGE电泳，发现冷处理样有两条分子量为分子量分别为7．3、6．1kDa的蛋白， 初步确定为冷应激蛋白。 段。 泳分析，得出Cspc、CspD的相对分子量分别为7、6．2kDa。 6．为了确定玲应激蛋白Cspc、CspD的作用。做了三个实验：11测定30℃菌体的生长曲线： 2)菌体生长到对数期中期(ODs】o=0．8)，转至7℃培养，测定低温刺激对苗体生长影响；3) 测定4个循环的冻一溶试验的活I暂数。通过空白菌株与重组菌株的比较，可以得出：Cspc使 菌体更加迅速的恢复了生长；冷应激蛋白CspD增强了菌体的抗冻存活率(增加了30-40倍)。 本课题的研究结果表明冷处理能提高苗体抗冻存活率，并发现了在冷处理条件下有7KDa 左右的冷休克蛋白的合成，这为乳酸菌中冷应激蛋白对低温受损伤菌体的改善作用提供了理 论依据。利并j 加迅速的恢复了生长；CspD增加了菌体冷冻存活率，但这种蛋白不是决定菌体抗冻性的唯 一因素。 关键词：乳酸乳球菌；冷应激蛋白；CspC、CspD基因克隆、表达及抗冻保护作用 Abstract ProteinsofL．1actisandTheir ofColdShock Expression Effectsin Cryoprotection Abstract all in Lacticacid rolethefood becauseoftheirwide important industry bacteda(LAB、play asstarterculturesin fermentation isoneofthemost application many processes．L／act／s．which LABinvolvedinthe afermentativemetabolismandwas important dairyindustry,have widely for daily like and adoptedmanufac