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乳腺癌细胞系分泌组学研究 摘要 分泌蛋白是癌症生物标志物的一个重要来源。为了寻找乳腺癌诊 断、治疗和预后的生物标志物，我们建立了多种研究乳腺癌细胞系分 泌蛋白组学的方法。 首 先 ， 我 们 建 立 了 优 化 的 半 鸟 枪 法 对 乳 腺 癌 细 胞 系 MDA-MB-231 的分泌组进行分析。通过改进的细胞无血清培养方法 和蛋白分离方法，从 MDA-MB-231 细胞无血清培养液中共鉴定出了 464 个蛋白，其中 84 个（22.8% ）是胞外蛋白，127 个（34.4% ）是 膜蛋白，比以往的细胞分泌组学研究结果有了改善。鉴定出来的丰度 最大的前 50 个蛋白中，分泌蛋白和膜蛋白比例增加，并且包括许多 已经被认为与肿瘤发生发展相关的潜在生物标志物。该结果说明我们 建立的优化的半鸟枪细胞系分泌组学分析方法，可以简单有效的从细 胞无血清培养液中寻找到潜在癌症生物标志物。 其次，我们建立了乳腺癌细胞系糖分泌组学的研究方法并将其应 用于潜在生物标志物的筛选。尽管我们优化了细胞的无血清培养条 件，但是不可避免的细胞死亡（死亡率3% ）释放出的胞内蛋白仍对 分泌蛋白的检测造成较大干扰。由于几乎所有的分泌蛋白都有糖基化 修饰，而且糖基化与癌症发生发展密切相关，因此本研究进一步提取 细胞分泌糖蛋白质组进行分析。用植物凝集素从浓缩的乳腺癌细胞 （MCF-7 ）及正常乳腺上皮细胞（MCF-10A ）的无血清培养液中提取 出特异结合的糖蛋白，酶解成肽段后用液相色谱与串联质谱联用 （LC-MS/MS ）的方法对其进行鉴定。共鉴定出 320 种蛋白，其中 92.2%被认为是糖蛋白，64.4%是分泌蛋白。比较 MCF-7 和 MCF-10A 的分泌糖蛋白发现，MCF-7 鉴定出了更多的糖蛋白，提示癌细胞的 糖修饰程度增加；其中有 140 个蛋白在癌细胞中表达量升高 1.5 倍以 上，这些蛋白有成为乳腺癌生物标志物的潜力。以上的结果表明针对 分泌组中的糖蛋白组进行分析是寻找癌症生物标志物有效的方法。 本工作中我们建立了两种分析和鉴定细胞分泌蛋白组学的方法。 前一种方法简单有效，后一种方法对分泌蛋白更具针对性。这些方法 的建立为进一步开展癌症分泌组学的研究奠定了基础。我们期望联合 运用多种方法分析多种乳腺癌细胞系的分泌组，从中鉴定出能高灵敏 度和高特异性的乳腺癌生物标志物。 关键词：蛋白质组学，分泌组学，乳腺癌，糖蛋白，生物标志物 Analysis of the Secretome of Breast Cancer cell lines ABSTRACT Secretome, the totality of secreted proteins, is viewed as a promising pool of candidate cancer biomarkers. In present work, we established several methods to identify secretome of breast cancer cell lines. First, we established an optimized semi-shotgun method to analyze the secretome of breast cancer cell line MDA-MB-231. We optimized the cell culture condition of MDA-MB-231 in serum free medium to control the cell death rate 3%. The concentration, desalting and fractionation of secretome sample were completed in a single step using the small reverse phase C2 column. We modulated flow speed and volume of graded elution buffer to