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实验八 微生物生理生化试验 1 菌种 大肠杆菌，普通变形杆菌，金黄色葡萄球菌，产气肠杆菌 2 培养基 尿素琼脂试管，蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基，葡萄糖发酵管和乳糖发酵管各3支。 3 溶液和试剂 甲基红指示剂，5％?萘酚，乙醚和吲哚试剂 4 仪器和其他用品 接种针 一 实验器材 二 目的要求 1 大分子物质水解试验 （1）证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统； （2）掌握微生物大分子物质水解实验的原理和方法。 2 IMViC试验 了解IMViC与硫化氢反应的原理及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。 3 糖发酵试验 （1）了解糖发酵的原理和在肠细菌鉴定中的重要作用。 （2）掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 三 基本原理 1 大分子物质水解试验 微生物对大分子物质如淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须依靠产生的胞外酶将大分子物质分解后，才能被微生物吸收利用。胞外酶主要是水解酶，通过加水裂解大分子物质为较小化合物，使其能被运输至细胞内。水解过程可通过底物的变化来证明，如细菌对大分子的淀粉不能直接利用，产生胞外酶(淀粉酶)将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖(或麦芽糖)，再被细菌吸收利用，这一过程可以用碘测定不再产生蓝色来证明；水解明胶可观察到明胶被液化；脂肪水解后产生脂肪酸改变培养基的pH，其中的中性红指示剂使培养基从淡红色变为深红色。 明胶是由胶原蛋白水解产生的蛋白质，在25℃以下可维持凝胶状态，以固体形式存在，而在25℃以上明胶会液化。有些微生物能产生明胶酶，水解明胶蛋白，而使明胶液化，甚至在4 ℃仍能保持液化状态。 有些微生物能水解牛奶中的蛋白质酪素，石蕊牛奶培养基由脱脂牛奶和石蕊配制而成，是昏浊的蓝色，酪素水解成氨基酸和肽后，培养基会变成透明。石蕊牛奶也用于检测乳糖发酵，在酸存在下，石蕊会转变成粉红色，过量的酸可引起牛奶的固化（凝乳形成），氨基酸的分解会引起碱性反应，石蕊变为紫色。某些细菌能还原石蕊，使试管底部变为白色。 尿素酶能分解尿素释放氨。尿素琼脂含有尿素、葡萄糖和酚红，酚红在pH6.8时为黄色，在培养过程中，产尿素酶的细菌将分解尿素产生氨，培养基的pH升高，在pH8.4时，指示剂转变为深粉红色。尽管许多微生物都可以产生尿素酶，但是利用尿素的速度比变形杆菌属的细菌要慢，因此尿素酶实验被用于从其它非发酵乳糖的肠道微生物中快速区分这个属的成员。 2 IMViC（吲哚、甲基红、伏－普和柠檬酸盐）试验 这四个试验主要是用来快速鉴别大肠杆菌和产气杆菌，多用于水的细菌检查。 吲哚试验是用来检测吲哚的产生，有些细菌产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚（红色化合物）。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚试验可作为一个生物化学检测的指标。 大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌为阴性。 甲基红试验是用来检测有葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖产酸时，培养基就会变酸，使加入培养基中的甲基红由橙黄色（pH6.3）转变为红色（pH4.2），即甲基红反应。利用该试验可区分大肠杆菌和产气肠杆菌。这两个细菌在培养早期均产生有机酸，但大肠杆菌在培养后期仍能维持酸性pH4，而产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使pH大约升至6。因此，此时加入甲基红指示剂，呈现黄色。 大肠杆菌为阳性（红色），产气肠杆菌为阴性（黄色）。 伏－普试验用于测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力，如丙酮酸。丙酮酸进行缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白胨中的精氨酸的呱基作用，生成红色化合物，即伏－普试验阳性，不产生红色化合物为反应阴性。 产气肠杆菌为阳性，大肠杆菌为阴性。 硫化氢试验也是检查肠道细菌的生化试验。硫化氢试验是检测硫化氢的产生，也是用于肠道细菌检查的常用生化试验。有些细菌能分解含硫的有机物如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐等形成黑色的硫化铅或硫化亚铁沉淀物，为硫化氢试验阳性，可用于鉴别细菌。 产气肠杆菌为阳性，大肠杆菌为阴性。 3 糖发酵试验 糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要，不同的细菌含有发酵不同糖(醇)的酶，因此不同细菌在分解糖类物质的能力上有很大的差异，有些细菌能分解某种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、甲烷、二氧化碳等）