生产菌种的扩大培养与保藏简介.pdfVIP

第七章 生产菌种的扩大培养与保藏 1 1 定 义 ? 种子扩大培养：是指将保存在砂土管、 冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种 接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇 瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数 量和质量的纯种过程。这些纯种培养物 称为种子。 2 2 作为种子的准则 ? 菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐 后能迅速生长，迟缓期短； ? 生理形状稳定； ? 菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的 要求； ? 无杂菌污染； ? 保持稳定的生产能力。 3 3 本章讲述的内容 ? 第一节 种子的制备过程 ? 第二节 种子质量的控制 ? 第三节 实例 ? 第四节 生产发酵罐的无菌接种 ? 第五节 菌种的保藏与复壮 4 4 第一节 种子的制备过程 ? 种子制备的过程大致可分为： – 实验室种子制备阶段 – 生产车间种子制备阶段 5 5 一、实验室种子的制备 ? 实验室种子的制备一般采用两种方式 – 对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁 殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子 ，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操 作简便，不易污染杂菌。 – 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种 ，可以用液体培养法。 6 6 （一）孢子的制备 1，细菌孢子的制备 细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮 源丰富的配方。 培养温度一般为37?C 。 细菌菌体培养时间一般为1~2天，产芽 孢的细菌培养则需要5~10天。 7 7 2 ，霉菌孢子的制备 霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉 米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基 。 培养的温度一般为25~28?C 。 培养时间一般为4~14天。 8 8 3，放线菌孢子的制备 放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培 养基，培养基中含有一些适合产孢子的 营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨 和一些无机盐等。 培养温度一般为28?C 。 培养时间为5~14天。 9 9 （二）液体种子制备 1，好氧培养： 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌 种，如产链霉素的灰色链霉菌（S. griseus ）、产卡那霉素的卡那链霉菌（S. Kanamuceticus ）可以用摇瓶液体培养法 。将孢子接入含液体培养基的摇瓶中， 于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌丝体 ，作为种子。 试管→三角瓶→摇床→种子罐 10 10 2 ，厌氧培养：对于酵母菌（啤酒，葡萄 酒，清酒等） 试管→三角瓶→卡式罐→种子罐 11 11 二、生产车间种子制备 ? 实验室制备的孢子或液体种子移种至种 子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不 同菌种而异，但其原则为采用易被菌利 用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等 ，如果是需氧菌，同时还需供给足够的 无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体 在培养液中均匀分布，获得相同的培养 条件。 12 12 1，种子罐的作用： ? 主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝 ）体，接入发酵罐能迅速生长，达到一 定的菌体量，以利于产物的合成。 13 13 2 ，种子罐级数的确定 ? 种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大 培养的次数，取决于： – 菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度 ； – 所采用发酵罐的容积 14 14 细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较 少，二级发酵。 茄子瓶→种子罐→发酵罐 霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵 孢子悬浮液→一级种子罐（27?C,40小时孢子 发芽，产生菌丝 ）→二级种子罐（ 27?C,10~24小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝 体）→发酵罐 放线菌：生长更慢，采用四级发酵 酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常 用一级种子 15 15 ? 确定种子罐级数需注意的问题 – 种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减 少染菌机会 – 种子级数太少，接种量小，发酵时间延长， 降低发酵罐的生产率，增加染菌机会 – 虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而 定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种 子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的 繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。 16 16 第二节 种子质量的控制 一、影响孢子质量的因素及控制 ? 培养基 ? 培养条件 ? 培养时间和冷藏时间 17 17 1，培养基 ? 生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主 要原因是原材料质量波动。 – 例如在四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基 用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同 对孢子质量的影响也不同。 – 蛋白胨加工原料不同如鱼胨或骨胨对孢子影响也不同。 ? 原材料质量的波动，起它要作用的是其中无机离子 含量不同，如微量元素Mg2+ 、Cu2+ 、Ba2+ 能刺激 孢子的形成。磷含量太多或太少也会影响孢子的质 量