酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae与酒酒球菌Oenos.oeni跨界融合子研究初报.pdfVIP

酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 与酒酒球菌 Oenos.oeni 跨界融合子研究初报 李 华，游 玲，刘晓晴，刘延琳 （西北农林科技大学葡萄酒学院 陕西杨陵 712100） 摘 要：本文对酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae 与酒酒球菌 Oenos.oeni 的跨界融合子 F-20-7 进行了筛选复壮，生产性能测试及相关基因鉴定。挑选出来的 9 个融合子，部分由于 丧失了一些生长代谢基因，不能在 YNB 及葡萄汁中生长；其中两株能够顺利进行酒精发酵， 并同时降解 70%以上苹果酸。在这些融合子的质粒 DNA 中发现了苹果酸乳酸发酵的两个关 键酶基因：苹果酸乳酸基因 Mle 及苹果酸乳酸通透酶基因 Mlep ，测序结果表明融合子质粒 中相应片段与 Genebank 中Mlep 基因序列的同源性高达 97%。这较好的解释了融合子的降 酸行为。 关键词：酿酒酵母 酒酒球菌 跨界融合子 筛选 鉴定 1 前言 酒石酸和苹果酸是葡萄中常见的两类固定酸，酸度过高会引起葡萄酒感官质量的下降； 而且苹果酸比较活跃，会引起葡萄酒的微生物病害，所以降酸是葡萄酒酿造过程中必不可少 的步骤。何忠宝于 2002 年首次采用跨界融合技术将葡萄酒酵母 1450 及酒类酒球菌 SD-2a 进行细胞融合，并获得一株融合子 F-20-7 。针对该融合子我们进行了一系列后续研究工作， 包括抗药性试验、复壮筛选、生产性能试验及分子生物学检验等。 2 材料与方法 2.1 菌株与培养基 葡萄酒酵母 1450：轻工业部菌种保藏中心 酒酒球菌 SD-2a：葡萄酒学院筛选保存 1450 与 SD-2a 的跨界融合子：葡萄酒学院存 培养基：YPD ，YNB ，模拟葡萄汁（成分略），天然葡萄汁。 2.2 主要仪器与药品 超净工作台 恒温摇床 霉菌培养箱 微波炉 显微镜 -20 ℃及常温冰箱 高速台式离心机 高速冷冻离心机 自动PCR 仪 电泳仪 凝胶成像系统 葡萄糖、苹果酸、柠檬酸，酒石酸、琼脂、酵母粉、蛋白胨、盐酸半胱氨酸、蜗牛酶、 溶菌酶、EDTA 、β-巯基乙醇、D- 山梨醇、氨苄青霉素、放线菌酮、PCRmix 试剂盒等。 2.3 筛选 在 YPD 培养基中分别加入氨苄青霉素 20ug/mL 酒酒球菌的致死浓度 、放线菌酮 50ug/mL 及 100ug/mL 酵母致死浓度 ，接入融合子单菌落，考察其生长状况。（见表1）。 挑选 50 个单菌落，分别接种到 YPD 液体培养基中进行苹果酸乳酸发酵，考察其降酸能 力。用苹果酸纸层析监测发酵过程，当出现的乳酸斑点不再扩大，即采用高压液相色谱检测 发酵液中的 L-苹果酸、L-乳酸含量：5ml 样品经 75℃蒸干，溶解于 5ml80%乙醇中，离心超 滤备用。流动相为 0.5%磷酸二氢铵，流速 1ml/min，检测波长为 210nm。 2.4 生长实验 测定融合子的生长曲线，与双亲对比：挑取少量融合酵母隔夜活化，按 1%的接种量接 种到YPD培养基中，28 ℃，150rpm振荡培养，每隔 1.5 小时取样测定其OD600 ，30 小时以内 可完成一个生长周期。 分别在 YPD 、YNB 、模拟葡萄汁及天然葡萄汁中接种融合子，观察其生长状况。 -1- 2.5 降酸实验 挑选数个融合子单菌落在含有 3g/L L-苹果酸的 YEPD 培养基中发酵，培养基中加入溴 甲酚蓝指示剂，发酵规模 100ml，纸层析监测降酸过程，待出现的乳酸斑点不再继续增大时， 采用高效液相色谱法检测 L-苹果酸、L-乳酸含量。 2.6 相关基因定位 提取葡萄酒酵母 1450、乳酸菌 SD-2a 及融合子的核 DNA ，针对苹果酸乳酸基因 Mle 及 苹果酸乳酸通透酶基因 Mlep 采用特异引物分别进行了 PCR 扩增。 提取葡萄酒酵母 1450 及融合子的质粒 DNA ，针对苹果酸乳酸基因 Mle 及苹果酸乳酸通 透酶基因 Mlep 采用特异引物分别进行了 PCR 扩增。 酵母 1450 及融合子核 DNA 的提取步骤参考文献4 进行；乳酸菌核 DNA 的提取参考文 献 5 进行。质粒 DNA 的提取参考文献 6 进行。 使用 PCRTaqMix 试剂盒对提出的八个 DNA 样品进行 PCR 扩增。 Mle 上游引物：5’-CGGAATTCATGACAGATCCAGTAAGTAT-3’ Mle 下游引物：5’-TAGGTACCACACTCTCAACACTCGTAAT-3’ Mlep 上游引物：5’-GCGAATTCATGAATGCTTTTATTACGAGT-3’ Mlep 下游引物：5’-TCGGTACCATTAGACA