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蛋白质融合表达的标签及切割研究 摘要：随着蛋白质组学技术的迅猛发展，重组蛋白的使用在近年来大大增加。许多蛋白质、结构域或者肽类能与目标蛋白融合。利用融合蛋白的有助于目标蛋白的纯化和检测这个优点被广泛赞同。本文对多种融合标签及切割方法做了简单的概述。 引言 近年来,一些抗原表位的肽类和蛋白质已被用于大量生产重组蛋白质.这些亲和标签系统具有以下特征: a 一步的吸附纯化, b 对三级结构和生物活性影响小, c 可方便且专一的去除以产生天然蛋白质, d 在纯化过程中重组蛋白的分析简便准确, e 适用于大量的不同蛋白质.有几种不同的策略用于大规模生产重组蛋白质.其中一种办法是使用很小的肽标签,这些标签不会与融合的蛋白质发生干扰.使用最为广泛的有多聚精氨酸,FLAG-,多聚组氨酸-, S-, and Strep II-tag等. 对于某些应用,小标签无需去除.这些标签不像大标签具有免疫原性,经常可以直接作为抗原用于产生抗体. 小标签对于融合蛋白的三级结构和生物活性的影响取决于标签的位置和氨基酸组成.另一种方法是使用大的肽类或蛋白质作为融合蛋白.，它们的使用可以增加目标蛋白的溶解性.缺点是对于一些应用如结晶或抗体产生等,标签必须加以去除.一般来说,对于特定的目标蛋白很难决定最佳的融合系统.这取决于目标蛋白本身 如稳定性,疏水性 ,表达系统,纯化后蛋白的用途. 1．融合标签 融合标签的作用是用于检测和纯化目的蛋白，有时也用来增加目的蛋白在细胞质中的可溶性或帮助将目的蛋白运转到细胞周质中以提高目的蛋白的生物活性。 亲和标签 基质 洗脱条件 Poly-Arg 阳离子交换树脂 在碱性pH 8.0 NaCl线性梯度0-400mM Poly-His Ni2+-NTA, Co2+-CMA Talon 150 mM 咪唑或低 pH 谷胱甘肽S-巯基转移酶 谷胱甘肽 5-10mM 还原型谷胱甘肽 Strep-tag II Strep-Tactin 修饰的链球菌抗生物素蛋白 2.5 mM 脱硫生物素 c-myc 单抗 低pH S,  RNaseA酶 的S片断 3M硫氰酸胍0.2M 柠檬酸pH 2,3M 氯化镁 HAT 天然组氨酸亲和标签 Co2+-CMA Talon 150 mM 咪唑或低 pH 钙调蛋白结合肽 钙调蛋白 EGTA 或1 M NaCl中加 EGTA 纤维素结合结构域 纤维素 1型:盐酸胍或者尿素大于4M 2/3型:乙二醇 SBP Streptavidin 链球菌抗生物素蛋白 2 mM 生物素 壳聚糖结合结构域 壳聚糖 内含子融合:30-50mM 二硫苏糖醇,β巯基乙醇,或半胱氨酸 麦芽糖结合蛋白 交联淀粉 10mM 麦芽糖 FLAG Anti-FLAG单抗 pH 3.0 或 2–5 mM EDTA 1 .1多聚精氨酸-标签 Arg-tag 精氨酸-标签通常由5或6个精氨酸组成.它已被成功用作细菌C末端标签,精氨酸是碱性最强的氨基酸,带5个精氨酸标签的蛋白质可以结合到阳离子交换树脂SP-Sephadex上, 而大部分杂蛋白不结合.结合后,带标签的蛋白质在碱性pH下运行线性NaCl梯度洗脱得到.当C末端为疏水性区域时,多聚精氨酸可能影响蛋白质的三级结构.氨酸残基的C末端序列可用羧肽酶B处理去除.这一酶促处理已被成功用于一些例子,但常常由于低的切割得率或者在期望的蛋白质序列间发生不必要的切割而受到限制.然而精氨酸标签并不常用,与第二标签联用是很有趣的蛋白质纯化工具. 1．2 多聚组氨酸-标签 His-tag 已广泛采用的方法是利用固定化金属螯合层析纯化带有由多聚组氨酸残基组成的一个短的亲和标签的重组蛋白质.固定化金属螯合层析的基础是固定在基质上的过渡态金属离子 Co2+, Ni2+,Cu2+, Zn2+ 与特定的氨基酸侧链之间的相互作用.组氨酸是与固定化金属离子作用最强的氨基酸,组氨酸的咪唑环作为电子供体容易与固定的金属离子形成配位键.基质材料洗涤之后,可通过调节柱缓冲液的pH或者添加游离咪唑洗脱含多聚氨基酸序列的肽类。虽然在变性条件下系统对于带6个组氨酸标签的蛋白质纯化有效,带3个组氨酸标签的蛋白质在生理条件下可有效纯化.然而带6个组氨酸标签的蛋白质可以在天然条件下,在低或高浓度盐的缓冲液中结合到Ni2+-NTA 基质上.结合后,目标蛋白可用0.8到250 mM咪唑梯度洗脱.低浓度的咪唑 如0.8 mM 可减少带有组氨酸的宿主蛋白质的非专一吸附.6个组氨酸标签的蛋白质可用20到250mM咪唑浓度范围洗脱. 使用咪唑的缺点是咪唑的存在经常导致蛋白质的聚集.另一种用于纯化多聚组氨酸标签蛋白质的材料是TALON.这由Co2+-羧甲基天冬氨酸 Co2+-CMA 组成,并偶