血浆中化合物A的HLC-UV分析方法的建立.docVIP

方法不算首创，只是在文献的基础上，结合自己实验室的现有条件和实际情况稍作改进，满足工作的需要。下面是我建立方法的过程，和大家分享。1 文献查阅? ?文献报道的测定该化合物的主要方法是液相色谱-紫外检测，只有一篇是液质联用的方法，考虑到这个项目样品多（2000多个），测定周期长和成本等，领导决定让我用液相来测定。查阅文献，我们可以从中获得一些基本的信息，如色谱柱类型、流动相性质、检测波长、前处理方法等。根据自己实验的要求，可能还要关注一下最低定量限、检测时间的长短等等信息。必要时可以做点笔记，把最关心的信息记录下来。根据文献获得的主要信息：1）色谱柱：均为C18，长度有150mm，200mm，250mm，内径和粒径分别为4.6mm和5μm；2）流动相：有机相是甲醇或乙腈，水相多为磷酸和磷酸盐缓冲溶液，pH值3～4；3）检测波长：225nm或者275nm；4）前处理方法：沉淀或者提取；5）最低定量限：0.2 μg/mL。；分析时间（液相）：13min左右。2 仪器的选择? ? 很多时候，仪器是没的选的，如果有条件的话，可以选择性能稳定的、操作方便的或者自己比较熟悉的仪器。当然还可以根据仪器一些自身的特点来选择，比如：如果流动相里面既有甲醇还有乙腈，尽量避免用Waters的，单向阀比较容易出问题；如果要跑梯度，尽量选择是高压混合的。我选择了Waters2695－2487（工作站：Empower） 3 色谱条件的建立? ? 这是过程可能很短很简单，也可能很漫长很费事，关键和很多因素有关，如化合物的性质、实验室现有的条件、成本、检测对灵敏度的要求等等，总之，就是要在满足检测要求的前提下，分析测试时间越短、成本越低、操作越简单越好。1）检测波长的选择? ? 文献报道的检测波长有225nm和275nm。一般说来（也有化合物例外），化合物在低波长段信号响应会好些，但是干扰也多，随着波长的增加，干扰会逐渐降低。不确定这两种波长的响应究竟差多少，我就拿紫外扫描了一下，的确225nm左右有最大吸收，而275nm处吸收太低，不可能满足我检测的要求，所以选择225nm作为我的检测波长。? ? 很希望275nm处有强的紫外吸收，这样就算比225nm处稍微响应低些，但是干扰少，基线平，色谱条件建立起来容易啊，可惜……2）色谱柱、流动相和内标的初步选择? ? 选择色谱柱主要是参考文献和实验室现有色谱柱的情况， C18柱（ODS柱）适合大多数非极性样品的分析，如果样品极性大，可以选择氨基柱、腈基柱和HILIC柱等，也可以选择正相系统。只是从反相系统向正相系统过渡的时候要注意，不然会引起整个系统的堵塞。? ? 我需要测定的物质A极性不大，文献报道基本都是C18柱，所以就用我们实验室最常用、储备也比较多的几根柱子开始摸条件，如Waters Symmetry C18，Agilent ZORBAX SB C18等（当然也是考虑了流动相的性质）。? ? 流动相考虑到成本和毒性，决定先试甲醇，水相就参考文献配了25mmol/L的KH2PO4溶液（pH3.0）。内标先试用了实验室现有的化合物，但是均与A的保留时间差的比较大，且相对靠前（血浆样品容易有干扰）。后来选用了文献报道的化合物B，出峰在A的后面，干扰少。? ? 总共比较了Waters Symmetry C18(4.6×150mm, 5μm) 、Waters Symmetry C18(4.6×75mm, 3.5μm)和Agilent ZORBAX SB C18(4.6×150mm, 5μm)三根柱子，最后选择了第二根色谱柱（尽管没有文献报道是用这么短的柱子的），原因是：? ? 1. Waters的这两根柱子都是Symmetry C18的，差别是长度和粒径，短柱子样品出峰快，样品与内标分离效果好，但是就是柱压高些。当用150mm的柱子进样，甲醇:水相＝72:28(v:v)，1ml/min, 225nm, 柱温35时，样品A的保留时间是tR=8.2min，内标B的保留时间tR=14min左右。这样的进样时间对于我来说太长了， 2300多个样品，保留时间的长短直接影响到我的进样时间，我希望保留时间再短些，这就意味着有机相的比例还要增加，但是由于水相有盐，有机相太高怕析出，而且成本也会增加，所以就选择了短柱。? ? 2. Agilent的柱子样品和内标的分离效果没有远没有Waters的好，如果要分开，那么两者的保留时间又会大于10min，但是柱压明显比Waters的低。 3）色谱条件的优化及前处理方法的选择我的原则就是前处理越简单越好，分析时间越短越好，分析成本越低越好。1．先拿样品及内标的对照品来初步确定色谱条件当然这只是初步看一下，看看标准品进样，灵敏度怎样