酿酒酵母的分离纯化副本.pptVIP

酿酒酵母的分离纯化 酵母的背景 　　酵母菌是发酵工业中重要的一类微生物，不但应用于面包、酒精等的发酵，而且近年来应用于石油发酵脱脂棉及糖化饲料发酵，还可以从酵母菌体中提取医药、食品和化工等方面的重要产物。 酵母菌是分属于子囊菌纲、担子菌纲、半知菌类的单细胞真菌微生物。多分布于高糖的偏酸环境，最适生长温度25℃~30℃， 兼性厌氧。酵母菌在通气充分时，进行好氧呼吸，生长代谢快，繁殖旺盛。厌气条件下，进行厌氧呼吸，通过相关代谢途径进行乙醇发酵，产生乙醇。 酵母的筛选 酵母菌在长期的白酒发酵生产过程中因不断的生长繁殖，将产生一定量的自发突变，一旦“耐酸突变”发生，耐酸突变个体因“自然选择与适应”，将出现并存活于窖底泥、黄浆水等低pH值环境中；因此，采用酸度呈梯度差异的选择培养基，利用微生物学、遗传学等的相关原理与技术方法，通过菌种的分离、纯化、扩培以及筛选、鉴定等相关试验，以pH值呈梯度差异的培养基为选择条件，进行了酵母菌的筛选。 开发设计 采集样品 增殖培养 （或富集） 纯种分离 原种斜面 筛选（初筛、复筛） 通过筛选的菌种斜面 性能鉴定 育种出发菌 菌种保藏 调查发现 酿酒酵母的筛选流程图 菌种保藏机构提供的纯种斜面 材料与仪器 低温保藏的酿酒酵母，麦芽汁培养基 9个平板、6支大试管、6支小试管、吸管（1ml、10ml）、涂布棒、三角瓶等待用 试验方法 1、酵母菌的分离接种 2、耐酸酵母菌的分离与筛选 3、性能鉴定 准备试验 （1）将实验所用的9个平板、6支大试管、6支小试管、吸管（1ml、10ml）、涂布棒、三角瓶等干杀待用 （2）用100ml容量瓶配制质量浓度为0.9%的生理盐水，分装入6支大试管，各9ml，121℃高压湿热灭菌15min （3）称取麦芽汁琼脂粉8g溶解至约200ml，加热煮沸，分装，121℃高压湿热灭菌15min （4）将湿热灭菌后的麦芽汁琼脂加热溶解冷却至约50~60℃，倒平板，9个板，每个约15ml；倒小试管，每管约5ml，制作斜面 分离接种 用接种针挑取适量酿酒酵母斜面培养物于三角瓶摇匀打散，用盛无菌生理盐水的大试管逐级稀释，血清计数，稀释至每毫升稀释菌液中含250~300个菌为止（计数板每中格约50~80个菌），取最终稀释液各0.1ml涂布在麦芽汁琼脂培养基平板上，置于30℃培养12h~24h。 酿酒酵母菌的筛选 初筛：对麦芽汁培养48h的酵母菌株， 以16×40倍的显微镜镜检，筛选出以多端出芽繁殖的菌株。 复筛：将镜检筛选出来的菌株，接种麦芽汁液体培养基，活化24h后接种到WL琼脂培养基，27℃培养5d后观察，选出菌落颜色为奶油色（浅黄色）至绿色，球形突起的表面光滑、不透明、奶油状的菌株。 赖氨酸培养基鉴定：酿酒酵母不能采用赖氨酸作为酵母氮源，因而在赖氨酸培养基上不能生长。将经过初筛和复筛的菌株，接种到麦芽汁液体培养基活化24h后，按照1%接种量接种酵母菌到5mL无菌水中进行饥饿处理，7d后接种到赖氨酸培养基，27℃培养5d后观察是否有酵母生长，培养48h后没有菌落出现的继续培养，直到15d后仍无菌落生长说明是酿酒酵母 性能鉴定 1 酵母菌株的耐酸性能测试：将选出的各酵母菌株，分别接种于不同pH值的麦芽汁培养基，培养观察各酵母菌株的生长状况，测定各酵母菌株的适宜生长pH值范围及种群密度。选择相对较低pH值条件下，生长较好的酵母菌株作后继供试菌。 2 耐酸酵母菌株的环境pH值变化适应能力测试：将在低pH值培养基中生长较好的酵母菌株， 分别接种于不同pH值的培养基中，培养观察供试菌对环境pH值变化的适应能力，选择在不同pH值的麦芽汁培养基中生长代谢都正常的酵母菌株，作后继供试菌株。 3 耐酸酵母菌株的相对生活力测试：将供试的各酵母菌株，分别接种于pH值相同的麦芽汁培养基，培养测定选出的各酵母菌株在特定pH值条件下生活力的差异性，选择生长较好的菌株作后继供试菌株。 4 耐酸酵母菌株的发酵环境生态适应性测试：将选出的耐酸酵母菌与其他非耐酸酵母菌，作混菌对比培养，选择相对生活力强、种群密度大的耐酸酵母菌株作后继供试菌株。 5 耐酸酵母菌株的生产性能测试：将选出的各耐酸酵母菌株，分别接种于常规酒精发酵培养基中。培养3d~6d后，定时观察、测定产酒情况、产酒与pH值变化的相关性，了解各酵母菌株的生产性能。 结果与讨论 1 通过冷藏酿酒酵母菌的增殖，找出最佳的各项生长条件 2 观察菌落形态上的差别、各菌株在增殖量和发酵力上的差别，选出优良菌株。 实验注意事项： 1无菌操作环节严格按照无菌操作进行 2各步骤实验条件尽量做到精确，使影响因素误差尽可能小 3各检测项目严格按步骤进行，保证更全面的生长因素统计分析，分离出更优良