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实验一: 双水相萃取牛血清蛋白 一.实验目的 1.了解双水相系统的成相原理和方法； 2.了解制作双水相系统相图的方法，加深对相图的认识； 3.掌握双水相溶液配制与双水相萃取的操作； 4.掌握分配系数和萃取收率的计算方法。 二. 实验原理 双水相系统是由两种互不相溶的聚合物（如聚乙二醇（PEG）与葡聚糖（DX））或者互不相溶的聚合物溶液和盐溶液（如PEG与（NH4）2SO4）组成。双水相系统的制备一般是将两种溶质分别配制成一定浓度的水溶液，然后将两种溶液按照不同的比例混合，静止一段时间，当两种溶质的浓度超过某一浓度范围时，就会产生两相。相图是研究双水相萃取的基础，双水相形成条件和定量关系常用相图来表示。图1是典型的高聚物-高聚物双水相体系的直角坐标相图，两种聚合物A、B以适当比例溶于水就会分别形成有不同组成的两相，上相组成用T点表示，下相组成用B点表示，由图1可知上下相所含高聚物有所偏重，上相主要含B，下相主要含A。曲线TCB称为结线，直线TMB称为系线。结线上方是两相区，下方为单相区，若配比取在曲线上，则混合后，溶液恰好从澄清变为混浊。组成在系线上的点，分为两相后，其上下相组成分别为T和B，T、B量的多少服从相图的杠杆定律。即T和B相质量之比等于系线上MB与MT的线段长度之比。又由于两相密度相差很小，故上下相体积之比也近似等于系线上MB与MT线段长度之比。 图1 A-B双水相体系相图 双水相萃取与有机溶剂萃取原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配原则。当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力（如憎水性、氢键、离子键等）的存在，使得待分离的物质在上、下相中的浓度不同。对于某一物质，只要选择合适的双水相体系，控制一定的条件就可以得到合适的分配系数，从而达到分离纯化的目的。本实验选择PEG-硫酸铵双水相系统萃取牛血清蛋白。 双缩脲反应是指蛋白质在碱性溶液中与二价铜离子结合生成紫色络合物的反应。含有两个或两个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应，蛋白质含有多个肽键，因此有双缩脲反应，反应生成物颜色的深浅与蛋白质含量成正比，因此可以利用双缩脲反应进行蛋白质的定量测定。 三、试剂及仪器 仪器：紫外可见分光光度计，电子天平，台式高速离心机，电热恒温水浴箱，漩涡混合仪，滴定管，大试管，离心试管(20mL)6只，移液管(1mL,5mL)，试管（10mL），注射器（10mL） 试剂：PEG2000，硫酸铵，牛血清蛋白，双缩脲试剂 四、实验内容 1、PEG2000-硫酸铵双水相体系相图的测定 （1）取50%的PEG2000溶液（w/v）10mL于大试管中； （2）用40%的硫酸铵溶液（w/v）装入滴定管中向大试管滴加，并不断在漩涡混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内液体出现浑浊为止，记录硫酸铵消耗的体积。加入1mL水使溶液澄清，继续用硫酸铵滴定至恰好混浊，重复7次，记录每次硫酸铵消耗的体积，计算每次出现混浊时体系中PEG和硫酸铵的浓度（w/v）,并填入表1中。 （3）以硫酸铵的浓度（w/v）为横坐标，PEG的浓度（w/v）为纵坐标作图，即得到PEG2000-硫酸铵的相图。 2、利用PEG2000-硫酸铵双水相体系分离牛血清蛋白 （1）利用双水相体系分离牛血清蛋白 根据相图，选择三个成相比例，分别加入3mL浓度为10mg/mL牛血清蛋白溶液。搅拌均匀，3500r/min离心5min，静置分层，分别量取记录上下相的体积。 （2）蛋白质浓度的测定 标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清蛋白（BSA）配制成10mg/mL 的标准蛋白溶液。 标准曲线的测定：取六支试管分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL的标准蛋白质溶液，并用水补足到1mL,然后加入4mL双缩脲试剂（A NaOH 3.5mL, B CuSO4 0.5mL），充分摇匀后在室温下放置30min，在540nm波长下测定吸光度。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照样。以蛋白质含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 样品的测定：按照标准曲线测定方法，分别取上下相溶液1mL置于两支试管中，分别加入4mL双缩脲试剂测定吸光度。与标准曲线对照，计算出牛血清蛋白的含量和萃取收率。 表1 PEG2000-硫酸铵双水相体系相图的制作表 编号累计加水量(mL) 硫酸铵溶液读数大试管中纯硫酸铵的累计量(g)溶液的总体积（mL）PEG2000的浓度(w/v)硫酸铵的浓度（w/v）1021324354657687 五、实验结果 1、根据实验所得数据，计算系统的相比，蛋白在不同双水相系统中的分配系数及收率。计算公式如下： 表观分配