实验三饮料中咖啡因含量的高效液相色谱分析.docVIP

实验三、饮料中咖啡因含量的高效液相色谱分析 ――外标法定量 一、实验目的 掌握高效液相色谱议的结构 巩固对反相液相色谱原理的理解应用 掌握外标法定量 二、实验原理 咖啡因又称咖啡碱，属于黄嘌呤衍生物，化学名为1，3，7－三甲基黄嘌呤，是从茶叶或咖啡中提取的一种生物碱。它能兴奋大脑皮层，是使人精神亢奋。咖啡因在咖啡中的含量约为1.2％～1.8％，在茶叶中约为2.0％～4.7％。可乐饮料、止痛药片等均含咖啡因。咖啡因的分子式为C8H10O2N4，结构式为： 在化学键合相色谱中，对于亲水性的固定相常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，这种情况称为正相化学键合相色谱法。反之，若流动相的极性大于固定相的极性，则称为反相化学键合相色谱法，该方法目前的应用最为广泛。本实验采用反相液相色谱法，以C18键合相色谱柱分离饮料中的咖啡因，紫外检测器进行检测，以咖啡因标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度作标准曲线，再根据试样中的咖啡因峰面积，由其标准曲线算出其浓度。 实验仪器和试剂 1. Agilent 1100 和Agilent 1200?高效液相色谱仪 2. 咖啡因（AR），超纯水由纯水机制得，甲醇为色谱纯3. 咖啡因标准溶液的配制 （1）标准贮备液 配制含咖啡因1000 ug/mL的甲醇溶液，备用。 （2）标准系列溶液 用上述贮备液配置含咖啡因20 ug/mL，40 ug/mL，80 ug/mL，160 ug/mL，320 ug/mL的甲醇溶液，备用。 1. 色谱柱（XDB-C18） 颗粒度为5 um的固定相，长150 mm 内径4.6 mm 2. 流动相 甲醇 : 水 = 60 : 40，流量 1 mL/min 3. 检测器 紫外光度检测器，2 nm 4. 进样量 0 uL 五、实验步骤 1. 将流动相甲醇和水分别过滤后于超声波发生器上脱气15 min. 2. 将配置好的分析试样分别过滤后于超声波发生器上脱气15 min. 3. 接通仪器和电脑电源，打开计算机，自动出现并运行Bootp Server程序（1200 LC 没有出现此界面）。 4. 从上到下依次打开 LC各模块电源。 5. 待各模块自检完成后，Bootp Server窗口显示6行仪器与计算机连接正常的信号后，（注意：Bootp Server程序窗口不能关），双击电脑桌面上的Instrument 1 Online图标，化学工作站自动与LC通讯，进入工作站画面。 6. 单击工作站画面的On按钮，系统Pump打开，并根据上次实验设定的流速和流动相开始工作（一般此时流动相是纯甲醇）。 7. 打开仪器上的Purge valve，则系统开始Purge，单击Pump图标，将流速设到2 mL/min直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止，切换通道继续Purge，直到所有要用通道无气泡为止。然后将流速设 mL/min，再关闭Purge valve。 . 单击Pump图标，进入Pump编辑画面，先用0.5 mL/min甲醇清洗仪器30 min，待仪器液路和电路系统达到平衡时，压力稳定，基线呈平直，再设定实验所需的流速和流动相。 . 单击泵下面的瓶图标，输入溶剂的实际体积和瓶体积。 1. 点VWD 图标，设定实验所需波长。 1. 待设定的仪器液路和电路系统达到平衡时，压力稳定，基线呈平直，将仪器调节至进样状态（Load位置），依次分别用专用的平头针头吸取0 uL的溶液进样并把进样阀扳到Inject位置。（每次进样前可在“Run control ”菜单中选择“Sample info”选项，输入操作者名称等信息，在“Data file ”中选择Prefix，并在Prefix 框中输入前缀，在Counter 框中输入计数器的起始位，仪器会自动命名，如vwd0001，vwd0002……）12. 分析结束后，从Run control 菜单中选择最后一项，即停止进样分析，此时仪器自动记录并积分色谱图。 1. 打印色谱图。 1. 待所有样品分析完后，单击Pump图标，进入Pump编辑画面，准备清洗仪器，本实验用0.5 mL/min的甲醇清洗仪器30 min，若实验过程用到酸或缓冲盐做流动相，须先用0.5 mL/min水清洗仪器60 min，再用0.5 mL/min的甲醇清洗仪器30 min。 1. 当仪器冲洗干净后，单击工作站画面的Off按钮，关泵，退出化学工作站，关掉Bootp Server窗口，关闭计算机（用shut down关），最后从下往上关掉LC电源开关。再关总电源。 1. 实验结束后做好仪器使用情况登记，经实验指导老师签名后方可离开实验室。 保留时间tR/min 峰面积A/mV·s 标准溶液20 ug/mL 标准溶液40 ug/mL 标准溶液80