可溶的天然有机质与吸附DNA的相互作用及它们对棕色固氮菌自然转化的影响.docVIP

可溶的天然有机质与吸附DNA的相互作用及它们对棕色固氮菌自然转化的影响 Nanxi Lu，Steven E. Mylon，Rong Kong，Rohit Bhargava，Julie L. Zilles，Thanh H. Nguyen 关键词：环境化学，天然有机物，胞外吸附DNA，自然基因转化，棕色固氮菌 摘要：为了更好地理解基因在土壤环境中的自然转化，我们对可溶的天然有机物（NOM）与吸附在硅表面的染色体或质粒的交互作用进行了调查。通过石英晶体微量天平测量吸附在硅表面上涂有DNA羧酸盐组密度水平基因转移染色体或质粒的吸附μmpore的醋酸纤维素过滤器piperazineethanesulfonic酸（HEPES）缓冲液和聚赖氨酸（PLL，σ）通过.0.22μm孔径的醋酸纤维素过滤器过滤，放在4℃下待用。 水生腐殖质和土壤腐殖质的羧基密度测定 我们使用NaOH电滴定法确定水生腐殖质和土壤腐殖质的羧基密度。每一种腐殖质样品溶液都从400ml稀释到以0.1 M NaCl作为背景电解质的最终浓度约6mg C / L的溶液中。每一个样品的100毫升的等分试样被转移到250ml三颈部血管滴定。样品pH调至3，用氮气吹扫气20min去除CO2，然后不断搅拌在氮气气氛下在滴定。将无碳酸的0.005M氢氧化钠注入入25.0ml微量滴定管中，将样品溶液滴定到pH为8，每次滴定需在10到15分钟内完成，至少重复滴定3次，每次滴定前需校准pH。从滴定结果看羧基浓度的计算要依靠电中性方程。羧基密度以毫当量/克作单位。 2.3 DNA的制备和表征 按前面所说的方法，从A.菌野生型（strain DJ，从Dennis Dean博士获得）中提取染色体DNA。将质粒pBR325（从德国购买）和pdb17（从Dennis Dean博士获得）导入大肠杆菌菌株DH5α中繁殖并使用Qiagen纯质粒抽提试剂盒。分别通过纳米微滴nd-1000测定DNA的浓度和大小和凝胶电泳。DNA文库被等分和存放在20℃环境下；它被加热到室温后立即使用含有1mM Ca2+（染色体）或1mM Mg2+（质粒DNA）MOPS缓冲液稀释至最终浓度为20mg/L。用傅里叶变换红外光谱分析，将用乙醇沉淀法将提取的DNA进行进一步浓缩至6000mg/L。 2.4透射电子显微镜（TEM） 将从透射电子显微镜下得到的二氧化硅吸附的DNA复合物的显微照片（JEM-2100，JEOL，东京，日本）在飞利浦CM12透射电镜的80 kV和X射线能量色散谱环境下处理。经DNA吸附后，离心1min后收集二氧化硅珠16900克，滴入几滴Karnovsky固定液，重悬20分钟。悬浮液通过300目的多孔碳包覆铜网过滤，并使用2%锇酸染色15分钟。 2.5溶解的NOM和DNA吸附层的相互作用 用QCM（D300，q-sense AB，哥德堡，瑞典）实时检测可溶的NOM吸附到DNA层上的过程。按以前的出版物所说的，该技术允许吸附的吸附层湿质量监测。在每个实验前，传感器需浸泡在2%hellmanex II(Hellma GmbH Co. KG, Müllheim, 德国)洗涤液中至少2小时，使用去离子水彻底洗净，用超高纯度氮气干燥，并用UV室氧化30分钟。将清洁传感器安装好，并配置径向停滞点流动单元，将细胞温度控制在25℃。 吸式注射器泵以0.1ml/min的速度将溶液进入传感器室。每次试验，都会首先注入去离子水，直到到达一个稳定的基线（变化频率为1到2Hz/h）。该传感器是平衡的电解质溶液，然后DNA吸附到传感器表面过程如下：首先锁相环层沉积，其次是土壤的NOM层，然后是一层前面所说的DNA层。为了探讨吸附DNA和可溶NOM的相互作用，我们监测是土壤的NOM或水生NOM溶液被引入到流动单元的频率变化。在NOM溶液中注入相同缓冲液，等待20~30min，直到饱和表面的频率变化趋于稳定。水生腐殖质溶液有0，10或100mg C／L的浓度，而土壤腐殖质溶液只有6 mg C/L一种浓度。每次实验后，将该系统用2% hellmanex II 洗涤剂冲洗30min，然后用去离子水洗至少2小时。在研究DNA层上的NOM附着物时，NOM附着率为频率与时间曲线的初始斜率。 2.6 吸附DNA的FIR光谱测量 红外吸收光谱使用珀金–埃尔默聚光400成像光谱仪,采用单元HgCdTe探测器液氮冷却的方式。溶解的染色体DNA（6000mg/L），纯二氧化硅微球，DNA吸附的硅珠都要进行测定。背景光谱要求在空白对照样品中加入两片CaF2。一份10μL样品加入1片CaF2，与另一份样品作对照。对照品和样品的单光束光谱使用100μM×100μm口径2cm?1的分辨率的仪器在同一采样点收集。扫描镜以1cm/s的速度在扫描仪器的光谱范围（7200–0cm