《PCR标本处理 防污染课件》.pptVIP

临床基因扩增检验标本 的采集、处理、保存 易珍 标本采集 在疾病发展过程中，标本采集过早或过晚都可能会给出假阴性结果。 　标本采集部位的清洁消毒可去掉污染的微生物或其他杂物，但应适度，过度清洁消毒有可能会去掉或破坏靶微生物，故标本采集部位的准备应由训练有素的人员进行。　 标本的类型和采集量 标本的类型：血清（浆）、分泌物、痰、尿和脑脊液等。 标本的采集量：应根据所测病原体而定。一般来说，如果标本的量对病原体培养够用的话，则其量亦足以用于核酸提取及其后的扩增检测 对于定量检测来说，对标本的收集要求更为精确。 采集质量的评价 血清（浆）标本：溶血、脂血等； 分泌物、痰：评价评价内容包括细胞组成，所需类型细胞的数量和核酸总量。 评价方法：包括肉眼观察，显微镜下观察和化学分析等。 采样及运输容器 标本的采集材料如棉签应为一次性使用； 运输容器亦应为密闭的一次性装置； 采集所用的防腐剂、抗凝剂及相关试剂材料不应对核酸扩增及检测过程造成干扰。 　　　　容器的使用 标本采集中的防污染 采集中要特别注意污染，防止混入操作者的头发、表皮细胞、痰液等； 如使用玻璃器皿，必须经高温灭菌，以使用可能存在的RNase失活。 标本运送 全血标本 1. 抗凝剂的选择 以全血作为待测标本 时，一般使用EDTA-Na2或枸橼酸钠，不可使用肝素。 2. 保存全血样本用于DNA提取检测，可 4℃下短期保存，如用于RNA检测，则应在取血后尽快提取RNA。 外周血单个核细胞 外周血单个核细胞可从抗凝全血制备，主要有两条途径，一是使用淋巴细胞分离液分离制备；二是使用红细胞裂解液，裂解全血中的红细胞，经生理盐水数次洗涤，即可看到单个核细胞。 保存 外周血单个核细胞如暂不提取核酸，可保存于-70℃下。 痰 特点 痰属于分泌物，痰标本中含有大量粘蛋白和杂质。 处理 1、如作结核杆菌DNA测定标本，提取核酸前，需对标本进行初步处理，即用1mmol/LNaOH液化。需注意的是，液化时不能加热，液化时间不能过长。 保存 液化标本如不立即用于核酸提取，可保存于-70℃下。 2、如用于非结核杆菌如肺炎支原体的PCR检测，痰标本的处理只能室温悬浮于生理盐水中，充分震荡混匀，促使大块粘状物下沉，取上清离心，所得到的沉淀物即可用于核酸提取。 棉拭子 使用PCR方法检测性疾病病原体时，临床标本一般为棉拭子，可将棉拭子置于适量生理盐水中，充分震荡洗涤后，取上清立即离心，其后的沉淀即可用于DNA提取。 保存 如不立即用于核酸提取，则需保存于-70℃下。 脓液 脓液的处理依情况而定。 如用于分枝杆菌（如结核杆菌）核酸测定的标本，粘稠的脓液可采用痰标本的处理模式，先进行液化，再离心取沉淀提取DNA；水样的脓液则直接离心，沉淀用于生理盐水洗2-3次后，即可用于DNA提取。 对于用于非分枝杆菌测定的脓液标本，如过于粘稠，则加入适量生理盐水，充分振荡后，静置，取上清立即离心，沉淀用于DNA提取；如为水样，则按上述直接离心取沉淀即可。 保存 沉淀标本的保存条件同样为-70℃。 体液 临床体液标本包括胸水，腹水，脑脊液，尿液等，可按水样标本的方式直接离心取沉淀提取核酸。沉淀样本的保存同上。 组织 组织分新鲜组织块和石蜡切片。 新鲜组织块的处理步骤 首先用生理盐水洗两次，然后将其捣碎或切碎，加入生理盐水后剧烈震荡混匀，离心，弃上清，再加蛋白酶K消化后提取核酸。 保存 新鲜组织最好是保存于50%乙醇中，具体作法是，先用生理盐水将组织洗一次，切成宽度小于1cm的小片，加入适量的生理盐水，然后，边摇边加入无水乙醇至浓度为50%，这样固定的组织标本室温下可保存数日，4℃可保存6年。 石蜡切片用于核酸提取，需先用辛烷或二甲苯脱蜡，再用蛋白酶K消化后可进行DNA提取。 小结 1、标本的收集及适当的预处理，对用于PCR测定的核酸模板的成功提取，具有决定性作用。 2、要着重强调的一点是，所有用于上述临床标本收集的容器如试管或离心管，均应使用前高压灭菌。 PCR污染与对策 PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与较高的灵敏性，但易污染，机器微量的污染即可造成假阳性的产生。 实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。如果一次试验中的几个阴性对照结果中出现一个或几个阳性结果，提示本次试验中其他标本的检验结果可能有假阳性。造成假阳性的原因包括样品污染 扩增试剂污染 扩增产物交叉污染等 常见的污染来源包括实验室环境、加样器、操作中形成的喷雾、DNA抽提、仪器、试剂及其他与扩增产物接触的物品。 污染的原