第四章核酸序列分析.pptVIP

一、双脱氧链末端终止法测序原理 普通的PCR反应体系中，加入的核苷酸单体为 4种2’-脱氧核苷三磷酸（dATP，dCTP，dGTP，dTTP） 一、双脱氧链末端终止法测序原理 测序反应体系中，加入的核苷酸单体为 2’,3’-双脱氧核苷三磷酸 （ddNTP） 多色荧光标记法 -- 荧光标记引物法 三、测序反应体系 1. DNA模板 2. 测序引物 3. DNA聚合酶 4. ddNTP 5. 荧光标记物 三、测序反应体系 1. DNA模板 单链DNA模板：如M13噬菌体，效果最佳 双链DNA模板：如T-easy载体 PCR产物：需纯化特异产物 三、测序反应体系 2. 测序引物 一般为通用引物，无需另外设计 三、测序反应体系 3. DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶I的大片段：持续合成能力弱（3-200bp），速度慢（16-20bp/s） 测序酶：T7噬菌体DNA聚合酶，无3’-5’外切酶活性，持续合成能力强，速度快 耐热的DNA聚合酶：用于循环测序，只需一条引物 四、自动DNA测序仪 1. 主要构成 测序反应系统 电泳系统 荧光检测系统 电脑分析系统 凝胶块区 自动进样器区 DNA测序图 五、测序策略 1.确证性测序：质粒载体，单向或双向测序 2.未知DNA序列的测定策略 较小的DNA片段：同确证性测序 大片段未知序列：鸟枪法、移步法 3.人类基因组计划 第二代基因测序技术 1.高通量 2.高准确度 3.不再局限于基因组测序 第三代基因测序技术 第三代测序技术是基于纳米孔的单分子读取技术， 测序数据更快，有望大大降低测序成本。目标是3分 钟内实现个人全基因组的测序，改变个人医疗的前 景。 本章小结 1.Sanger测序技术的原理及特点 2.荧光染料标记法测序原理 3.荧光染料标记方案及比较 4.全自动测序仪的大致工作原理 热板 毛细管 雷射检测器 注射器驱动杆 毛细管和电极 注射器 正极缓冲液 泵块 自动进样器 负极缓冲液 PE310 基因分析仪的基本结构 C G T A C G C A T G A 激光检测器检测特征性的荧光光谱 DNA测序图 第二代DNA测序技术 第二节 边合成边测序（Illumina Solexa） 焦磷酸测序（罗氏/454） 第三代DNA测序技术 第三节 Solexa并没有采用间接反应（焦磷酸氧化荧光素）的形式激发光信号，而是直接在dNTP上连接荧光基团和阻断基团，通过“去阻断—延伸—激发荧光—切割荧光基团—去阻断”这样一个循环的方法来依次读取目的DNA上的碱基排列顺序。如下图所示，该原理在基础篇的Solexa宣传视频中亦有提及。由于采用了可逆阻断技术（即在dNTP上连接可剪切的阻断基团），Solexa测序的每一步只延伸一个碱基，不会出现类似于454测序的同聚物影响准确性的问题，因此其单碱基准确性较高，但随着读长的增加，荧光信号会有所衰弱，所以越“靠后”的碱基准确性会逐渐降低，这也是Solexa测序读长受限的一个主要因素。 454的焦磷酸测序原理，简单来说就是利用DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的协同作用，将PCR反应每一个碱基（dNTP）的延伸与一次荧光信号的释放偶联起来，通过记录荧光信号的有无和强度，达到实时测定DNA序列的目的。在454测序仪中，A、T、G、C四种碱基是分别存储在单独的试剂瓶中的，每步反应四种碱基依次加入反应池，当碱基配对结合，就会释放出一个焦磷酸（PPi），而这个焦磷酸在酶的作用下，将荧光素氧化成氧化荧光素，并发出光信号，从而读取出这一位置的碱基信息。? ? 454测序仪的整个实验步骤可大致概括为：样品处理、文库制备、emPCR、反应板准备、上机测序。样品处理主要是针对大片段的DNA分子，如基因组DNA、Fosmid或BAC质粒等，利用超声或氮气打断将这些DNA分子片段化，然后采用琼脂糖凝胶电泳回收或磁珠纯化，选择500-800bp的DNA片段。对于非编码RNA或PCR产物，则不需要这一步骤。文库制备包括接头连接和磁珠纯化两步，454的文库接头分A、B两种，各44bp，由20bp的PCR引物、20bp的测序引物及4bp（TCAG）的“key”碱基构成，其中B接头的5’端带有生物素（Biotin）标记，用于磁珠纯化步骤。经过磁珠结合与DNA变性之后，只有A+目的片段+B形式的连接产物得以富集，另两种形式（AA、BB）的产物都被去除。emPCR是454测序的一个关键步骤，将富集到的文库与测序磁珠、各反应物混合，加入特定的矿物油和表面活性剂，再利用振荡器剧烈振荡，使反应体系形成油包水（water-in-oil）的稳定乳浊