第三章PCR.pptVIP

PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 * 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够）； 《基础生物化学实验》（第二版） 生物化学实验 聚合酶链式反应 （Polymerase Chain Reaction，PCR） 一、PCR技术的原理 是在体外模拟体内DNA复制过程快速扩增DNA的方法。 以待扩增的DNA分子为模板，以1对与模板互补的寡核苷酸片段为引物，以dNTPs为底物，在DNA聚合酶作用下，经过高温变性、低温退火和适温延伸三个阶段的循环，依半保留复制机沿模板合成2条新的DNA分子。重复这一过程，可使模板DNA以几何级扩增（2n）。 实际往往可以将微量目的DNA片段扩增一百万倍以上。 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 子链延伸 DNA加倍 DNA变性 形成2条单链 模板DNA 95℃ 95℃ 50℃ 引物1 引物2 DNA引物 50℃ 引物1 引物2 DNA引物 72℃ Taq酶 Taq酶 72℃ 第1轮结束 95℃ 第2轮开始 95℃ 50℃ 72℃ Taq Taq Taq Taq 72℃ 第2轮结束 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 PCR的反应体系 标准的PCR反应体系（ 100ul ） 模板DNA 0.1～2ug 引物 10～100pmol 4种dNTP混合物 各200umol/L 10×扩增缓冲液 10ul Mg2+ 1.5mmol/L Taq DNA聚合酶 2.5u 加蒸馏水至 100ul  可根据实际需要进行调整 PCR的反应条件 PCR的反应条件 ※ 温度 ※ 时间 ※ 循环次数 变性 93-97?C 延伸 72?C 退火 40-60?C PCR的特点 灵敏度高 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 病毒检测的灵敏度可达3个PFU 细菌检测的最小检出率为3个细菌 简便、快速 一次性加好反应液，约2小时完成扩增 扩增产物一般用电泳分析 对标本的纯度要求低 绝大多数组织的粗提DNA 引物设计： （1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布，G+C尽量不超过60%。 （4）引物内部避免形成二级结构；两引物间避免有互补序列。 （5）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。 （6）引物5’ 添加酶切位点。 PCR技术的主要用途 目的基因的克隆 基因的体外突变 DNA和RNA的微量分析 DNA序列测定 基因突变分析 二、操作 1.PCR的反应体系的配制 2×Mixture 12.5 μL H2O 9.5 μL 模板DNA： 1 μL P1（20μM） 1 μL P2（20μM） 1 μL 25μL 2.反应体系混匀。 二、操作 3. PCR程序 （1）94℃ 5 min （2）94℃ 30s （3）60℃ 30 s （4）72℃ 30 s （2）-（4）步 30个循环 （5）72℃ 5 min 二、操作 4. 1.5%琼脂糖凝胶电泳 （1）上样量：5μl PCR产物 （2）分子量标准：DL2000 （3） V=120, 30min 5. 在凝胶成像系统中观察并记录实验结果 三、结果 M 阴 1 2 3 4 5