第七章植物花药和花粉培养及单倍体育种.pptVIP

3、外植体消毒 4、接种 5、培养 6、植株再生 7、生根 8、驯化与移载 9、单倍体植株的染色体加倍 旗叶鞘用70％酒精擦洗一遍 剥去旗叶鞘，取出稻穗 10％漂白粉10 min 无菌水洗3次 培养5天，花药变褐，20天后花药裂开，长出淡黄色的花粉愈伤组织，先长芽，后长根，形成幼苗。 用接种环接种到培养基上 左手持穗，右手用镊子取花药，放无菌培养皿中 水稻花药培养过程 Figure Anther culture and haploid plants regeneration Anther at the onset of the culture. (b) Anther after 6 days in culture. (c, d) Embryos emerging from the anthers after 30 days in culture, showing roots (c) and shoots (d). 三、花粉培养 1、花粉 习惯上，把处于四分体到单核早期的花粉称小孢子。进入单核以后则称为花粉。 2、花粉培养成苗途径与花药培养比较: 相同点：胚状体成苗途径、愈伤组织再分化成苗途径 不同点：花粉培养：花粉分离收集及培养方式(需进行花粉的分离特殊的花粉诱导培养) 花药有药壁(2n)、药隔(2n)、花粉(n)等，因此，再生植株有可能来自药壁(2n)、药隔(2n)、或起源于数个花粉(n)的嵌合体。 游离花粉粒培养，再生植株为纯合体。 3、花粉培养 优点（与花药培养比）：a、花药培养容易受药壁、花丝、药隔等体细胞组织的影响，再生植株会出现不同倍性的个体，而分离的花粉培养可以克服这一不足。b、能更好调节控制核发育的各种因子，而且可以直接从单细胞开始观察整个雄核发育的过程，为研究雄核的生理生化等问题提供方便。c、原则上将，从花粉培养能得到更多的花粉植株。 4、花粉的分离 花粉分离收集：由于花粉包于花药内，必须将它们从花药中分离、收集才能进行培养。 方法： （1）机械挤压法：主要有挤压法和研磨过滤收集法 A、 挤压法：是将花药消毒后，加入少量的分离溶液，用镊子或小玻璃棒将花粉从花药中挤压出来，通过不锈钢网或尼龙网筛去组织碎片， 收集悬浮液，然后用30％蔗糖离心收取悬浮在蔗糖溶上层的完整花粉粒，再用培养基洗涤几次后用于培养。 B、研磨过滤收集法：在无菌条件下，将采集到的花蕾经表面消毒后剥离出花药，再将花药置于无菌的研钵中研磨并挤出小孢子，同时滤去药壁等大的组织碎片，经离心收集后接种于适宜培养基上进行培养的方法。 （2)自然散落法：将花药接种于液体培养中，使花粉自然释放，再进行收集培养。 （3）机械游离法:主要有磁搅拌法和小型搅拌法。 磁搅拌法：利用机械力使花药壁破裂至花粉溢出的方法。 小型搅拌法：又称超速旋切法，是通过转轴的高速转动带动花蕾、穗子切段或花药高速运动而使之破裂，从而使小孢子游离出业，经过分级过筛收集后进行培养。 5、花粉纯化：需经过筛、梯度离心、收集等步骤。 梯度离心前 （小孢子形态、活力不一致） 30%蔗糖梯度离心后 （获得均一的小孢子群体） 6、花粉的培养方法： 　　平板培养 花粉置琼脂固化培养基上培养。 　　液体培养 花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。 　　双层培养 花粉置固体-液体双层培养基上培养。培养基制作方法：先铺一层琼脂固体培养基，凝固后，在表面加入少量液体培养基。 　　 　　看护培养 利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。 　　微室培养 利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养 　　条件培养 利用培养过花药的液体培养基或含失活花药提取物的培养基上培养。花药条件培养基、子房条件培养等。 花粉培养示意图 取花蕾（镜检） 预培养数天 取花药 消毒 分离花粉 接种 培养 愈伤组织发生 7、影响花药培养和花粉培养的因素 （1）基因型：不同基因型的培养难易及植株再生有很大差别。 （2）植株的生理状态和环境条件：母体植株的年龄和所经历的环境条件如：光周期、光照强度、温度等对以后的花粉离体培养有很大影响。一般田间比温室，幼龄比老龄植株易于培养。 　（3）花粉的发育时期：只有发育到某一时期的花粉对离体刺激才最敏感因此选择合适的花粉发育时期的花药很关键，多数植物单核期的花粉培养容易成功。 　（4）培养基：基因型不同，所需培养基种类，蔗糖浓度以及添加激素种类和浓度不同。加入活性炭可提高花粉植株的诱导率。花药组织的存在对小孢子的胚性分裂具有明显的促进作用。但花药壁损伤会释放有毒物质影响小雄核的发育。 （5）预处理：