小鼠肝组织RNA提取及RTPCR实验.pptVIP

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2015-09-17 发布于湖北
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小鼠肝组织RNA提取及RTPCR实验.ppt

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小鼠肝组织RNA提取及RTPCR实验.ppt

小鼠肝组织RNA提取及RT-PCR 一、试剂及材料 1、小鼠肝脏 2、DEPC处理过的EP管、PCR管 3、 Trizol 、氯仿、异丙醇、DEPC水二、实验原理三、实验步骤 RNA提取 1、新鲜肝组织置EP管中，加200?l Trizol充分研磨后，补加800?l Trizol，枪头吹匀。 2、加入200?l 氯仿，剧烈震荡15秒，4℃ 12000g离心15min。 3、将上层水相移至洁净EP管中，加入500?l异丙醇颠倒混匀。 4、4℃ 12000g离心10min。 5、弃水相，EP管开盖干燥，溶于50?l DEPC水中。 RT-PCR：RNA的反转录 + cDNA的PCR RT-PCR操作步骤 5x Prime Script Buffer 2 ?l ① Prime Script RT Enzyme Mix 0.5 ?l ② Oligo dT primer (50 ?m) 0.5 ?l ③ Random 6 mers (`100 ?m) 1 ?l ④ 提取的RNA 0.5 ?l RNase Free 水 5.5 ?l ⑤ 37℃ 15min 85℃ 5 sec PCR 10x PCR Buffer 5 ?l dNTP 4 ?l 模板DNA 2 ?l 引物1 2 ?l 引物2 2 ?l Tag 酶 0.5 ?l H2O 34.5 ?l 94℃ 5 min 94℃° 30 sec 54℃° 30 sec 72℃ 30 sec 72℃ 7 min * TRIZOL：异硫氰酸胍 + 苯酚裂解细胞，RNA与蛋白质分离，将RNA释放到溶液中。促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层。 RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。 10 ?l 50 ?l 25 cycle 20 ul 样本 4 ul loading buffer 1 ul DNA 染料 1%琼脂糖凝胶电泳观察结果 *