感受态细胞的制备及质粒转化.docVIP

感受态细胞的制备及质粒转化 实验目的 学习和理解影响细胞感受态的因素，掌握感受态细胞的制备方法。掌握质粒的转化方法。把体外DNA引入受体细胞，使受体菌具有新遗传性，并从中选择出转化子。 实验原理 受态就是细菌吸收转化因子的生理状态，只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来的DNA分子。转化的基本原理是细胞处于0℃，CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－钙磷酸混合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在选择性培养基平板上培养，可选出所需的转化子。 实验仪器： 恒温培养箱涂布器离心机离心管试剂： LB培养基0.1mol/LCaCl2溶液(灭菌备用)。 材料：自制的质粒DNA大肠杆菌(E.coli)菌种(DH5α菌株)。 1．从新活化的E.coliDH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于mL液体培养基中，37℃振荡培养过夜，直至对数生长期。将该菌悬液以1：0接种于LB液体培养基中，37℃快速振荡培养～h。 210min， mL的Eppendorf管各加入1.5mL菌液，4000rpm离心min，弃上清，再加1.5 mL菌液，重复一次，最后收集到3mL培养液的菌体。 3．μL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞，000rpm离心min。 ． 用加样器将残余液体尽量净，加入00μL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置，即制成了感受态细胞悬液。感受态细胞悬液6．制好的感受态细胞可在冰上放置，24h内直接用于转化实验，也可加入占总体积95％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于E管中，-70℃条件下可保存半年至一年。 (二)细胞转化-70℃下保存的感受态细胞，室温下解冻后放置于冰上。 2. 取pBS质粒DNA溶液，体积不超过10(l，轻轻摇匀，冰上放置。 3. 取出三个分别装有100,50,50(l感受态细胞悬液的Eppendorf管，分别编号1,2,3。 4. 在1号管中加入5.0(l已连接好的质粒DNA溶液，在2号管中加入1.0(lpUC19质粒溶液，3号管做空白对照，冰浴10min。 5. 42 ℃水浴中热击90秒, 热击后迅速置于冰上冷却5min。（此步是通过热击法使DNA吸附于受体菌细胞膜上，一定要轻轻操作，且一定要严格计时.） 6. 向管中加入900(l LB液体培养基(不含Amp)，混匀后37 ℃下震荡培养1小时使细胞恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。 (三)平板培养μl、100μl、100μl、150μl、150μl、200μl、200μl培养液分别涂布于七个含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上，分别做标记。 质粒对照组：从2号管中取50μl培养液涂布于含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上，分别做标。 受体菌对照组：从3号管中分别取50μl受体菌培养液分别涂布于不含有氨苄青霉素和含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上，分别做标记。 8. 正面向上放置半小时，等菌液完全干后倒置平皿37℃下培养16-24小时，出现明显而未相互重叠的单菌落。 9. 培养后，将平皿于４℃下放置数小时，使显色完全。 注意事项 1．这一个实验中的所有操作均要为无菌操作，在超净工作台内进行。 2．细胞转化中，42℃水浴90s要准确操作。 3．制备感受态细胞过程中，需要在冰上放置的一定不要在室温中放置。 4. 做梯度培养是不清楚在哪个浓度下细菌生长良好且为单菌落存在，所以需设置梯度。 5．涂布棒是玻璃的，用酒精烧灼灭菌后，不易冷却，需等它冷却后再开始涂布平板。 6．涂布时要从低浓度到高浓度涂布，不要随便打乱顺序，否则会使本来低浓度的平板含有过多菌液。