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中国试剂网 3.9.256 与DNA 结合蛋白相作用的启动子序列的鉴定 番茄子叶细胞核的分离提取为例子进行实验 步骤2～7 须在4 ℃下使用高压灭菌过的设备进行。 1．将番茄种子种在灭菌的水饱和滤纸上，置于小盆内，用薄膜封口后，培养 7 天。用刀片切下番茄子叶后收集备用。 2 ．将40～50g 新鲜组织放入300ml 匀浆缓冲液，用韦林氏搅切器先1×4 秒而后 6 ×1 秒。 3 ．过滤匀浆混合液，使其透过漏斗上的4 层厚纱布及纱布下按孔径递减次序放 置的3 层Nitex 尼龙筛网 （300 μm ，100 μm ，52 μm ），汇入大烧杯中。全部匀 浆物均滤完后把纱布集中在一起，将纱布上的滤液压入尼龙网，并使其经漏斗流 入烧杯中。切勿将滤液压出尼龙网，亦不可使用抽滤，让滤液靠重力作用下流。 4 ．将每批滤出的匀浆倒入 500ml 离心瓶中，用 Sorvall GS－3 转头 5000r/min （4225g ），4 ℃离心20 分钟。 5 ．吸去上清，然后将核粗提沉淀物用大口径塑料巴斯德吸管温和地反复吹吸， 使沉淀悬浮于匀浆缓冲液中。将重悬起的沉淀转入50ml 离心管中，用匀浆缓冲 液调节体积至约40ml 。 6 ．4 ℃用Sorvall SS－34 转头4000r/min （1912g）离心10 分钟，再次沉淀细胞 核。重复步骤5 和6 三次，分别在3500r/min 离心10 分钟，8 分钟和6 分钟。最 后一次离心后，尽可能洗净匀浆缓冲液。 7 ．将核悬浮于核悬浮缓冲液中，按每50g 植物组织加0.5ml 核悬浮缓冲液。用 液氮冷冻，保存于－80℃。若核蛋白抽提即将进行，可不必将核冷冻起来。 核抽提物的制备 1．将细胞核置于冰上解冻，精确测定核悬浮液的体积。 2 ．加入核裂解缓冲液，使NaCl 终浓度为0.47 mol/ （即，每毫升核悬浮加入182 μl 核裂解液）。 3 ．将核悬浮液置于摇床上，4 ℃温和摇动30 分钟。 4 ．4 ℃微量离心20 分钟沉淀染色质。 5 ．小心移出上清，避免搅起胶状的含 DNA 的沉淀，以使抽提液中避免含有此 类杂质。 中国试剂网 3.9.256 6 ．4 ℃透析上清3～4 小时，中间换几次透析液。 7 ．将透析液用液氮冷冻，再置于冰上解冻，4 ℃微量离心或用Sorvall SS－34 转 头10 000r/min （12 000g）离心15 分钟，弃沉淀，保留上清。此步骤是为了将其 余可能在浓缩步骤中阻塞微量浓缩器的蛋白质沉淀除去。 8．用 CENTRICONTM10 微量浓缩器浓缩上清，以使提取液中蛋白质的终浓度 为 1～3mg/ml 。可以溶菌酶为标准物用Bio-Rad Bradford-based 蛋白质分析试剂 盒来测定蛋白质浓度。经验表明，要达到上述浓度，至少需要浓缩2～3 次。 9 ．留出待作迁移分析的核抽提物，将剩余部分用液氮或干冰冷冻，贮于－80℃ 备用。 DNA 片段的标记  聚丙烯酰胺凝胶的制备 1．安装凝胶装置并洗净玻璃板。 2 ．配制4 ％丙稀酰胺凝胶液，将以下成分混合： 丙稀酰胺/双丙稀酰胺 （29 ：1） 4ml TBE （10×） 3ml APS （10％）