液相方法的建立步骤.docVIP

液相方法的建立步骤? ?? ?? ?? ?有关样品的情况，明确分离目的？? ?? ?? ?? ?是否需要特殊的HPLC步骤，样品预处理等？? ?? ?? ?? ?选择检测器和检测器设置？? ?? ?? ?? ?选择液相色谱方法；进行预实验；估计最佳分离条件? ?? ?? ?? ?优化分离条件? ?? ?? ?? ?检查出现的问题和所需的特殊情况? ?? ?? ?? ?1.回收纯化的物质? ?? ?2.定量校正? ? 3.定性方法??? ?? ?论证方法进入常规实验室? ?? ?开始前应该知道? ? 样品的组分和性质? ? 所含化合物数目? ? ? ?? ???化合物化学结构? ? ? ?? ???化合物分子量? ? ? ?? ???化合物Pka值? ? ? ?? ???化合物UV光谱图? ? ? ?? ???化合物在样品中的浓度范围? ? ? ?? ???样品的溶解度? ? ? ? 分离的目的? ? 1.定性还是定量？一种（不希望有的）物质的检出？未知样品组分的确认？纯物质的分离？? ? ? ?? ?? ?? ?? ?? ???2.是否有必要解析出样品的所有成分？? ? ? ?? ???3.如需要定量分析，准确度和精确度需要多大？（精确至±1%-2%? ? ? ?? ?? ?? ?? ?? ???4.该方法需要设计多少种不同的样品基质？特殊化合物可能以不同的样品形式出现（原料药，一种或多种形态，环保样品），是否需要一以上的HPLC方法？单一或类似方法分离不同形态样品是否理想? ? ? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ???5.一次将分析多少种样品？? ? ? ?? ???6.即将使用的该HPLC方法中，有那些HPLC设备？实验室人员的操作技能如何？色谱柱是否恒温？HPLC是否能做剃度洗脱？该方法是否可在不同设计的生产设备上运行，尤其柱外峰展宽的老设备上？操作者有怎样的HPLC经历和培训？? ? ? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ? 样品预处理或检测? ? 1.可直接进样的溶液? ? ? ?? ???2.需稀释，PH缓冲，加入内标或其他定容操作的溶液? ? ? ?? ?? ?? ?? ?? ???3.必须首先溶解或提取处理的固体? ? ? ?? ???4.样品需处理以除去干扰物及保护色谱柱和仪器不受损害? ? ? ?? ?? ?? ?建立分离方法? ?? ?样品的性质? ?? ???CE??GC??HPLC??SFC??TLC??? ? 一般样品? ? 特殊样品? ? ??中性的??离子的? ? 无机离子? ? 检测最重要，选离子色谱??研究实验（反向）? ?? ?异构体? ? 可用一般HPLC（一般柱或环糊精硅胶柱）分开做一般样品处理??等度? ?? ?对映体? ? 手性条件??剃度? ?? ?生物样品??肽类????离子对? ?? ???糖类????NARP? ?? ???核苷酸??正相? ?? ?大分子??蛋白质? ?? ?? ? 核酸? ?? ?? ? 糖类? ?? ?? ? 合成聚合物RHPLC首选条件? ? 色谱柱??15×0.46CM，5μM，C8/C18? ? ? ? 流动相??缓冲液（25mM磷酸钾，PH2-3）-乙腈（80：20-0：100），? ? ? ? 添加剂??胺改性剂，离子对不用? ? ? ? 流速??1.5-2? ? ? ? 温度??35-45? ? ? ? 样品大小??小于25微升/100微克? ? 目标??分离度??精密和普适好的定量Rs大于1.5? ?? ???分离时间??5-10分钟日常工作理想? ?? ???定量??精密度含测小于2%；痕量小于15%? ?? ???压力??小于150BAR最佳，不大于200BAR? ?? ???峰高??大信噪比的窄峰最好? ?? ???溶剂消耗??每次运行少用流动相最好? ?? ?定量方法论证? ? 专属性? ?? ?? ? 线性? ?? ?? ? 准确度? ?? ?? ? 精密度? ?? ?? ? 回收率? ?? ?? ? 灵敏度? ?? ?? ? 重现性??柱间重现性? ? 方法建立和论证期间可能出现的问题? ?? ?? ? ??理论塔板数低??色谱柱选择不对，二次保留，峰形不好的影响? ?? ???色谱柱易变性??色谱柱选择不对，二次保留? ?? ???色谱柱寿命短??色谱柱选择不对，样品需预处理，键合相流失? ?? ???定量精度差??需更