化学去细胞同种异体神经制备的改良及桥接周围神经缺损效果.docVIP

化学去细胞同种异体神经制备的改良及桥接周围神经缺损效果 　作者：王冠军 卢世璧 孙明学 许文静 张莉 郭全义 彭江 赵斌 作者单位：解放军总医院全军骨科研究所,北京 100853 　【摘要】目的：改良去细胞异体神经的制备方法，研制出一种理想的自体神经移植替代物. 方法：将用Sondell法（Triton X100、脱氧胆酸钠）和改良法［Triton X200，sulfobetaine10（SB10）,sulfobetaine16（SB16）］两种方法制备的去细胞异体神经用HE染色、髓鞘染色、免疫组化染色、扫描电镜检查等进行组织学评价. 然后将制备的神经桥接大鼠坐骨神经缺损，从坐骨神经指数、神经电生理、运动终板染色等方面评价神经移植后的再生效果. 结果：改良法制备的神经细胞及髓鞘去除彻底、结构保存完好；移植后神经再生良好，优于Sondell法制备的神经，达到了与自体神经移植相当的再生效果. 结论：综合运用萃取剂Triton X200,SB10和SB16的改良化学萃取方法是一种较为理想的去细胞异体神经制备方法，其制备的异体神经移植物可望替代自体神经移植. 　【关键词】 周围神经 化学萃取 去细胞异体神经 神经再生 神经缺损 0引言 周围神经缺损的修复是临床上的难题，目前主要采用自体神经移植修复，但此方法有诸多缺点，且常因供体有限，无法满足较大神经缺损或较广泛神经损伤修复的需要［1］. 异体神经来源广泛，但新鲜异体神经移植会出现导致移植失败的免疫排斥反应. 采用化学萃取方法能较好地降低异体神经的免疫反应［2-3］，但由于处理方法的不同，有时对神经的结构破坏太大［2］. 本研究旨在改良去细胞异体神经的制备方法，即综合应用萃取剂Triton X200，sulfobetaine10（SB10）和sulfobetaine16（SB16），并与目前得到认可的Sondell化学制备方法（应用萃取剂Triton X100和脱氧胆酸钠）进行比较；并将改良制备的异体神经桥接周围神经缺损，评价其再生效果，以期研制出一种理想的自体神经移植替代物. 1材料和方法 1.1材料健康成年SD大鼠26只，雌雄不拘，体质量270～300 g，用于去细胞异体神经制备. 健康成年Wistar大鼠24只，雌雄不拘,体质量300～320 g，用于神经移植动物实验. 上述动物由解放军总医院动物中心提供. 回旋式恒温振荡器(上海跃进医疗仪器厂)；环境扫描电镜（QUANTA 400，清华大学）；显微外科器械，手术显微镜，便携式肌电图仪（Medtronic Keypoint，丹麦）；TritonX 100，脱氧胆酸钠，Triton X 200 ，SB10，SB16(美国Sigma公司). 1.2方法 1.2.1去细胞异体神经制备将SD大鼠26只用100 g/L水合氯醛以0.4 ΜL/g腹腔注射麻醉后,切取双侧全长坐骨神经，每根神经长约20 mm. 分3组进行处理：Sondell法组（10只）、改良法组（10只）和对照组（6只）. Sondell法处理步骤为：①蒸馏水中振荡浸浴12 h；② 30 g/L Triton X100溶液中振荡萃取12 h；③ 40 g/L脱氧胆酸钠溶液中振荡萃取24 h；④重复上述步骤1次；⑤蒸馏水冲洗30 min. 改良法处理步骤为：①蒸馏水中振荡浸浴12 h；②125 mmol/L SB10溶液中振荡萃取12 h；③1.4 g/L Triton X200和0.6 mmol/L SB16溶液中振荡萃取24 h；④重复上述步骤1次；⑤ 0.01 mmol/L PBS（pH 7.2,下同）冲洗30 min. 处理后的神经于4℃的PBS液中储存备用. 对照组神经不作化学处理. 1.2.2移植手术将Wistar大鼠随机分成3组，每组8只. Sondell法组用Sondell法制备的异体神经移植；改良法组用改良法制备的异体神经移植；对照组用自体神经移植. 造成坐骨神经10 mm长缺损，手术显微镜下将移植物用80无损伤尼龙线与断端吻合. 对照组将自体神经近、远端翻转后吻合. 1.2.3去细胞异体神经质量评价光镜观察：常规石蜡包埋, 5 Μm的横向和纵向组织学切片. HE染色,观察去细胞程度和围绕神经轴突的基底膜管结构的完整性；快蓝(fast blue)染色,观察髓鞘残留成分；基底膜素（laminin）免疫组化染色，观察基底膜素的保留. 电镜观察：于20 g/L OsO4溶液中固定24 h后，二甲胂酸钠缓冲液冲洗，滤纸蘸干水分，投入液氮中冷冻，取出后迅速切成5 mm小段，