松材线虫和拟松材线虫分离方法的改进及其食道腺分泌物的提取和比较.pdf

中文摘要 松材线虫和拟松材线虫分离方法的改进以及两种线虫 食道腺分泌物的提取和比较分析 (摘要) 松材线虫(鼓，耶ap船，鲫曲船秒』咖j』“甸是寄生于松属植物的一种线虫，它 能引起松树萎蔫病，导致大量的木材损失，在国内被列为重要的检疫对象。目前， 该病在日本、中国、美国、加拿大、韩国等国家都有分布，因危害严重，难于防 治从而受到世界各国的重视。其中，中国和日本受害最严重。它不仅给林业生产 带来巨大损失，而且造成生态景观的破坏。因此，对松材线虫致病机理的研究具 有重要的理论和实践意义。 很多学者对松材线虫病的病因及其致病机理进行了研究，然而松材线虫引 起松树萎蔫病的致病机理目前还不明确，伴随科学工作者对植物寄生线虫的深入 研究，发现线虫的食道腺分泌物在其取食过程中起着重要的作用，所以松材线虫 食道腺分泌物对寄主细胞及其新陈代谢影响的分子机制日益受到研究者的关注。 长期以来，由于松材线虫个体微小，且易和真菌的菌丝以及细菌等杂质混在一起， 从而影响试验的准确性，因此得到纯净的线虫材料对实验研究至关重要。由于松 材线虫和拟松材线虫食道腺很小，其分泌物的量更是甚微，因此如何提取足量的 食道腺分泌物成为实验研究的关键。因此，本研究工作主要对松材线虫和拟松材 分析食道腺分泌颗粒蛋白含量的变化，进而提取食道腺分泌物进行电泳分析。主 要研究结果如下： 1．线虫分离方法的改进：用裂褶菌培养繁殖松材线虫后，当用浅盘法收集 时，线虫的悬浮液中含有大量类似线虫形状的菌丝以及大量的细菌，从而使以需 要纯净松材线虫为材料的研究无法进行。本文通过用90目／平方毫米的筛子自制 度的蔗糖溶液为离心介质进行二次分离试验，得出30％(w／w)的蔗糖溶液效果 最好，能够把松材线虫和断裂菌丝分离。本文还分别以硫柳汞、硫酸庆大霉素、 青霉素、链霉素、K．Medium的无菌去离子水这五种药物溶液进行线虫消毒灭菌， 同时以空气刺激法来观察这些药物是否影响线虫的活性，结果是：K—Medium的 中文摘要 无菌去离子水效果最好，在不影响线虫活性同时，能够通过渗透原理使大部分细 菌膨胀致死，最终达到了松材线虫和杂质的最好分离。为收集大量纯净的松材线 虫提供了方法。 2．药物对食道腺分泌物蛋白合成的影响：本文在提取松材线虫和拟松材线 虫的食道腺分泌颗粒时，用间苯二酚和二甲基亚砜(DMSO)线虫悬浮液刺激一 段时间(8 h)，分光光度计(uu800)检测发现药物刺激后可收集较多的线虫食道 腺分泌颗粒蛋白。仅用间苯二酚刺激线虫，食道腺分泌蛋白有所增加，但与对照 组相比差异不显著；而单独用二甲基亚砜刺激与对照组没有明显的区别。因此间 苯二酚起到了刺激线虫食道腺蛋白分泌物合成的作用，而二甲基亚砜这一万能溶 媒起到了对间苯二酚的增溶作用以及使其快速渗透到线虫体内的作用。 3．松材线虫和拟松材线虫食道腺分泌物的电泳分析：本文对松材线虫南黑、 拟松材线虫挪威以及F1三个株系食道腺分泌颗粒蛋白的提取物分别进行了初步 PAGE电泳谱带有7条带，拟松材线虫挪威以及F1均是8条带，三者近似共享3 带有2条(78．3KD和67．9KD)，而SDSPAGE显示松材线虫特有的蛋白带有6条 材线虫的致病过程中可能具有重要的作用，这有待于今后进一步的研究。 F1一直是在分类上有争议的株系，而本实验中，通过食道腺分泌颗粒成分 初步分析比较可推测Fl属于拟松材线虫。 关键词：致病机理食道腺分泌物空气刺激DMS0间苯二酚电泳松材线 虫拟松材线虫 英文摘要 An MethodforIs01ationand Improved PurificationofPineWood Nematodesand of ComparativeAnalysis Secretion Esophageal Between口H咒呷厅Pf细c厅l￡s^咖AfZ‘蜉and矗，