骨髓间充质干细胞分离培养和在移植肝中定居能力的研究.docVIP

骨髓间充质干细胞分离培养及在移植肝中定居能力的研究 　　作者：朱金海,陈燕凌　　作者单位：福建医科大学 附属协和医院肝胆外科，福州 　　【摘要】 目的 体外分离培养并鉴定扩增大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)，观察MSC在肝移植受体内的定居能力。 方法 直接贴壁法培养大鼠MSC，绘制细胞生长曲线;流式细胞仪检测细胞表面标志。定向诱导MSC向成骨和成脂肪分化，鉴定其多向分化潜能。DAPI荧光标记MSC，由门静脉注入肝移植受体，取肝组织冰冻切片，观察其在移植肝内的定居情况。 结果 直接贴壁法成功分离培养MSC，并在传代培养中得以纯化扩增。传代周期约5 d，可在体外传代20代以上，具有强大的增殖能力。流式细胞仪检测符合MSC表型。MSC可成功分化为成骨细胞和脂肪细胞，具有多向分化的能力。DAPI标记MSC的阳性率达100%。荧光显微镜观察，可见MSC定位于移植肝内。 结论 直接贴壁法分离培养MSC简单易行,获得MSC纯度高，生物学特性稳定;MSC可以在移植肝内存活并定居。 　　【关键词】 分离培养; 鉴定; 大鼠; 肝移植 　　骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)是一种成体干细胞，具有高度的增殖能力和多向分化潜能。国内外学者将MSC应用于急性心肌梗死、脑梗死、肝功能衰竭、大面积烧伤等组织创伤修复上，取得了显著的效果。MSC具有免疫原性低、自体或异体植入无明显排斥反应、体外转基因效率高的特点，是基因工程的良好载体。笔者对MSC进行分离培养及表型鉴定，并观察其在同种异体肝移植受体内的定居情况。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物和试剂 3～4周龄雄性SD大鼠，体质量80～100 g，清洁级，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[许可证号为SCXK(沪)20070005]。胎牛血清(美国Hyclone公司)，LDMEM培养基(美国Gibco公司)，CD34FITC抗体、CD90FITC抗体、CD44PE抗体、CD45PE抗体、CD11bPE抗体(英国AbD公司)，DAPI试剂(美国Sigma公司)。 　　1.2 MSC的分离培养及传代 大鼠脱颈处死，75%酒精浸泡10 min，取股骨及胫骨，用加有肝素的LDMEM培养基反复冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞。1 000 r/min离心10 min，用含10%胎牛血清的LDMEM混匀，以2×105 cm-2密度进行接种，培养于37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度的培养箱内。2 d后全量更换培养液，去除未贴壁的细胞。每2～3 d换液1次，倒置显微镜下观察细胞生长情况和形态特征。原代细胞80%～90%融合时，0.25%胰酶进行消化约2～3 min，1∶2比例进行传代。 　　1.3 MSC生长曲线绘制 取第3代细胞，以1×104 mL-1细胞悬液分别接种于24孔培养板中培养，每孔1 mL。每日取出3孔，连续7 d，消化后细胞计数，绘制生长曲线。 　　1.4 流式细胞仪检测MSC表面标志 取第3代MSC，接近90%融合时，PBS洗2次，0.25%胰酶消化，1 000 r/min离心5 min，取1×106细胞悬于100 mL PBS中。分别加入CD34、CD44、CD45、CD90、CD11b抗体至饱和浓度，室温避光反应30 min，PBS洗涤，以FCM Buffer固定细胞，流式细胞仪进行检测。 　　1.5 体外诱导MSC成骨、成脂肪分化 取第3代MSC，每孔1×105接种到六孔板，24 h后加入诱导介质。成骨诱导介质为LDMEM，含10%胎牛血清、10 mmol/L Β磷酸甘油、100 nmol/L 地塞米松和0.2 mmol/L抗坏血酸。成脂诱导介质为LDMEM，含10%胎牛血清、1 Μmol/L地塞米松、5 Μg/mL胰岛素、0.5 mmol/L 1甲基3异丁基黄嘌呤(IBMX)和60 Μmol/L吲哚美辛。每周换液2次。诱导两周后分别用茜素红和油红O溶液染色来检测骨细胞中的矿物质沉淀和脂肪组织中的中性脂肪滴。 　　1.6 MSC在移植肝内定居能力的观察 (1)DAPI荧光标记MSC：第3代MSC生长到80%融合后，更换培养液，将荧光染色剂DAPI加入培养的MSC上清中，终浓度为50 mg/L，孵育30 min，PBS洗去未结合的DAPI，荧光显微镜下观察。(2)大鼠原位肝移植模型建立：按文献[12]的方法采用改良的二袖套法进行大鼠原位肝移植，供受体均为SD雄性大鼠。(3)MSC在移植肝内定居情况观察：在受体肝移植完成后，将DAPI标记的MSC消化后，配制浓度为2×106 mL1，4号针头门静脉穿刺后，缓慢推注入MSC细胞1 mL，压迫数分钟观