水稻氨基酰化酶的基本性质、固定化及其催化动力学的研究.pdfVIP

水稻氨基酰化酶的基本性质、固定化及其催化动力学研究 景飞 李绪渊” 李华 刘宏伟 柴荚梅 (兰州大学化学化工学院，兰州 730000) 5 {氨基酰化酶(EC…31．14)广泛存在于动物、植物和微生物体内。由于它具有专一性催 ’ 化水觯N一酰基化一L一氨基酸的功能，可被用来拆分化学合成的DL--氨基酸的混合物蛳 制取光学纯D一型和L一型氨基酸，早已引起人们广泛关注．但有关其固定化和动力学的研 究尚见报道不多。提纯到了水稻氨基酰化酶，并以D。为载体对其实行了固定化，以N一乙 酰一DL～甲硫氨酸为底物的催化水解反应，研究了溶液酶和固定化酶和基本性质和催化动 力学规律，并对二者的催化作用进行了比较，得到了较好结果，为水稻氮基酰化酶的应用提 供了理论依据和技术信息。＼ l、实验 1．1 酶活性的测定：依文献121报道的茚三酮显色法进行，以N一乙酰一DL甲硫氨酸为 mol·din-3的N一乙 底物，测定水解产物L一甲硫氮酸的量。反应液中1．0m10．05 酰一m，一甲硫氨酸，1-5m10．2 25℃下反应30min，加入0．05m110％的三氯乙酸终止反应。 (固定化酶为0．029)l p 酶活力定义为每分钟释放l mol的L一甲硫氨酸的酶量作为1个酶活力单位． 1．2 蛋白含量的测定：采用Lawry法I：I．以牛血清白蛋白(BSA)作标准． 1．3 mo]·dm-3NaOH、 固定化载体的处理t称取一定量的D2…依次用70％乙醇、1 0．5tool n01-dⅢoHCl和0．2 dm4(NH4)2SO．、2 mol·dm4PBs(pH7．5)分 别处理1小时，水洗抽滤。至溏液呈中性。特干燥后投入到20％的戊二醛和二乙 醇胺的混合液中(V／V=4：I)．25℃下搅拌反应30mtn，水洗抽滤．然后用浸没量 的0．1mol／LHCl处理30rain，水洗抽干待用。 1．4 酶的固定化：将一定量处理好的干燥载体投入到浓酶液中(蛋白浓度10mgtml)， 室温下搅拌6小时，抽滤，用PBS(pH7．5)洗至pH值不变，即得到固定化酶。 4C下保存12小时，自然干燥。 2、结果与讨论 2．1 固定化酶载量与活性：通过称量载体担载酶蛋白前后质量的变化，计算得到固定 化酶蛋白载量为7．1mg·(gdrycarrier)一，活力测定表明固定化酶活力为514u·(g carrier)-I dry 2固定化酶活力回收率为72％，高于文献报道每高值650／．I“。 2．2酵括性最适作用温度和最适pH值：分刷测定在不同温度和不同pH值缓冲液中． 溶液酶和固定化酶催化水解N一乙酰一DL一甲硫氨酸的括性规律，得知溶液酶的 最适作用温度为弱℃，最适作用pH值为7．5，而固定化酶的最适作用温度为砷 ℃．最适作用pH值为7．0。显然固定化酶的最适作用温度和最适pH值忧于溶液 酶。 2．3 催化动力学及参数：在pH值为7．5的缓冲液中分别以相同量的溶液酶和固定化酶， 在不同的温度下改变底物浓度，测量反应30min后溶液酶中生成的L一甲硫氨酸 的量．计算出酶促反应速度，以IN～I／[S]作图，发现该酶伲反应服从米氏机理。 所得结果见表l。以l赡K．～l／T作图，按照Arthenius公式求得溶液酶 通讯联系人：车绪洲 ——1069—— 率较溶液酶略有降低；活化能略有提高。 表1．溶液酶催化N一