实验6——可溶性蛋白质测定.pptVIP

实验六：可溶性蛋白质的测定（考马斯亮蓝G-250法） 1．实验原理　　 考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素络合物在595nm波长下有最大光吸收。其吸光值与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。 2. 适用范围与特点 该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法（劳里法）还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0~1000μg/mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。 该法的不足是当蛋白质含量过高时，线性关系较差，重复性也较差，同时染料很容易结合到比色皿上，给实验结果造成一定误差。 3. 实验材料、仪器与试剂 材料：豆芽 仪器：可见分光光度计，分析天平，容量瓶，移液管，具塞刻度试管，研钵，漏斗，铁架台，玻璃棒。 试剂：考马斯亮蓝G-250，无水乙醇，磷酸，牛血清蛋白。 试剂配制： 考马斯亮蓝G-250试剂：称取0.1000g考马斯亮蓝G-250，溶于50mL95%乙醇中，加入85%磷酸100mL，用蒸馏水定容至1000mL。 标准蛋白质溶液（100μg/mL）：称取0.0100g牛血清蛋白（BSA），溶于100mL蒸馏水中。 4. 实验步骤 （1）样品处理： 准确称取5g豆芽于研钵中，充分研磨后转移至100mL容量瓶中，静置20min后过滤，弃去初滤液后备用。 （2）标准曲线的绘制 取6支10mL具塞试管，按上表加入试剂，混合均匀后，向各管中加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，稀释至刻线10mL（则蛋白质浓度分别为0、2、4、6、8、10μg/mL ），摇匀，放置5min后于595nm波长下比色。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 （3）样品的测定 另取3支10mL具塞试管，分别吸取样品溶液0.6mL，各加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，稀释至刻线10mL，充分混合，放置5min后于595nm波长下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。 5. 结果计算 6. 注意事项 （1）考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。 （2）考马斯亮蓝有G-250和R-250两种。 蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。 考马斯亮蓝R-250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但可以被洗脱下去，所以可用来对电泳条带染色。 （3）不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。 （4）H+浓度是影响线性关系的主要因素，控制好显色液的H+浓度就能使被测液的吸光度与蛋白质浓度之间保持较好的线性关系，用HCl-NaCl缓冲液代替磷酸缓冲液也能改善标准曲线的线性关系。 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 BSA（mL） 100 80 60 40 20 0 蛋白质含量（μg） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 水（mL） 6 5 4 3 2 1 蛋白质含量（%）= C×V2×V0 m×V1 × 100 式中： C——从标准曲线上查得的蛋白质浓度，g/mL V0——样品溶液的总体积，mL V1——测定时加样量，mL V2——测定时定容体积，mL m ——样品的质量，g