小麦叶片DNA提取.docVIP

小麦幼嫩叶片DNA的提取-----CTAB提取法 试剂准备： 打开水浴锅，设定65度：同时将CTAB提取液放入水浴锅中预热 冰无水乙醇（预冷） CTAB提取液 氯仿异戊醇 离心机 含有1%~2% RNase（10mg/ml）的ddH2O 70%乙醇 β-巯基乙醇： 1%-2% RNase溶液： 1%-2% 实验步骤： 将新鲜小麦叶片保存在-70度冰箱，用时取出。1、称取小麦叶片2克左右，放入研磨钵中，倒入液氮，将其研碎成粉末。2、将粉末装入2ml离心管(可不灭菌)中；同时将CTAB提取液放入水浴锅中，加温至65度。 小三角瓶盛50mlCTAB，放入65度水浴锅中， 巯基乙醇 1%-2%都可以，这次给你加的是2%，即用1000ul的 枪，加了1枪。之后放入水浴锅中，用的时候摇匀一下。 3、向试管中加入800ul的CTAB提取液4、充分振荡后，放入65度的水浴锅中，大约60分钟；其间，每隔15分钟轻轻的摇 晃离心管，使溶液和粉末充分混合。 这里的充分震荡所采用的方法是，用枪头去搅动。用手去搅动，使其混匀。 温育开始计时后，将异丙醇预冷。取24支1.5ml的离心管（这时用的离心管就是第七步中提到的离心管，灭过菌的离心管），摆放于孔板上，用枪加入600ul的异丙醇，加好后，盖好盖子，写上四个材料的标号。之后放入-20度的冰箱进行预冷。5、60分钟后，取出水浴加热的材料，冷却至室温，加入等体积（800ul）的氯仿异戊醇（24：1），充分混匀。 6、然后将离心管放入离心机中离心，转速12000rpm，时间10min 7、取上清液至另一离心管（必须经过灭菌）中，再吸取等体积的氯仿异戊醇，混匀离心，重复上述步骤。8、再一次吸取上清液，加入2倍于该上清液体积的冰无水乙醇，轻轻混匀（因为此时 DNA已有少许絮状沉淀，避免DNA断裂），放入4度冰箱中，大概1小时左右。9、将DNA沉淀用玻璃器皿将其挑到1.5ml的离心管中，用70%的酒精清洗两遍，放 放入室温下风干 10、溶解DNA。—20℃保存备用。-  DNA提取步骤； 1.将适量新鲜叶片(或冻叶)放入1.5ml Eppendorf中，置于冷冻干燥机内16~20h，破碎仪下（频率30次/秒，1min）使其破碎成粉。 2.加入0.6ml 65℃预热的提取缓冲液（CTAB Buffer），并用200μl枪头搅匀，65℃水浴60~90min，其间每隔15min混匀一次。 3.取出后，置于室温，加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1）混合液，颠倒混匀200次左右（5~10min），12000rpm离心10分钟（25℃）。 4.取上清液，移至预冷的0.8体积的异丙醇内，颠倒混匀，静置，可见沉淀产生。若无明显沉淀，则12000rpm离心5分钟，弃上清。 5.钩出DNA沉淀，70%乙醇洗涤两次，每次20分钟，晾干，加入适量含有1%~2% RNase（10mg/ml）的ddH2O溶解（一般为300ul）。 6.用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和纯度。 试剂的配置： CTAB Buffer （100ml，实际使用可按比例增减） 1.0M Tris-Cl 8.35ml 0.5M EDTA 3.35ml 5.0M NaCl 23.40ml CTAB 1.675g H2O 64.90ml 注意：使用前加入1mlβ-巯基乙醇（1%~2% w/v） 提完以后，若长久保存，就放-20℃冰箱；若经常用，比如今天用，明天又要用，就放4℃。不要频繁冻融，老是解冻，DNA会降解。 RNase干粉，从公司购买 RNase稀释液，浓度为10mg/ml 用来溶解DNA的Rnase使用液，是含有1%~2% RNase（10mg/ml）的ddH2O RNase干粉 → RNase稀释液（10mg/ml）的方法： ？？？ 本实验室me师姐的配制方法: 干粉规格：25mg 保存液： 5mg/ml 使用液：含1%~2%的RNase（10mg/ml）的无菌水 由于本实验室的保存液浓度较低（5mg/ml），所以在溶解DNA时的无菌水可适 当提高RNase（5mg/ml）的使用量。 即应该是 含2%~4%的RNase（5mg/ml）的无菌水。 一般情况下按4%来加水溶解DNA. RNase（5mg/ml）溶液的配制过程： 干粉25mg，加入1000 ul无菌水，离心，震荡，离心。 分装成5管，即每管200 ul，再分别加入800 ul的无菌水，震荡混匀。 金属浴5min，之后室温冷却。-20度存放。 注意：要等金属浴升温到100度以后再放进去。并计时5min。中间不能走开，因为管子受热会崩开，你要及时把它盖上。