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实验二 淀粉酶产生菌的发酵条件优化 一、目的要求 了解酶制剂生产过程中实验室发酵条件优化的基本方法。 二、基本原理 用微生物生产酶制剂受以下制约： 培养基成分 物理条件 为了得到最佳产酶量，必须对这些因素进行优化，并通过单因子分析、正交试验找出最适合的发酵工艺条件。 二、基本原理 1、碳、氮源是组成微生物细胞蛋白质、酶和核酸的主要元素之一，是影响酶产量的两个重要因素。 二、基本原理 2、α-淀粉酶产生菌的发酵是好氧过程，因而发酵液中的溶氧浓度是发酵过程中的一个需要调节的重要参数。 二、基本原理 3、接种量大小是决定菌体在发酵培养基中生长速度的一个重要因素，选择适当的接种量是必要的。 三、器材 （一）试剂 1、碳源：葡萄糖、麦芽糖、糯米淀粉、可溶性淀粉、马铃薯淀粉。 2、氮源：蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、NH4AC、NH4NO3、( NH4)2SO4。 3、酶活测定试剂：同实验一 （二）培养基 1、种子培养基LB（100mL） 蛋白胨 1.0g 酵母膏 1.0g NaCl 0.5 g pH 5.5 （二）培养基 2、发酵培养基（100mL） 可溶性淀粉 2.0g 蛋白胨 0.5g 酵母膏 0.5g KH2PO4 0.1g MgCL2·6H2O 0.05g CaCL2·2H2O 0.01g pH6.0 （三）仪器 300mL三角瓶、 移液管、大试管、培养皿、 pH试纸。 电子天平、超净工作台、培养箱、恒温调速摇瓶柜、离心机（离心管）、恒温水浴锅、分光光度计、比色皿、记时器、电冰箱。 四、操作步骤 （一）菌种准备 （二）碳源对发酵产酶的影响 （三）氮源对发酵产酶的影响 （四）装液量对产酶的影响 （五）接种量对产酶的影响 （六）培养基pH对产酶的影响 （七）正交实验 （一）菌种准备 1、菌种活化：试管保存菌种→LB平板→37℃培养48h 2、液体培养：将菌种接种入装有30mL种子培养基的250mL三角瓶内，于37℃，200rpm，培养16h。 （二）碳源对发酵产酶的影响 1、碳源种类对发酵产酶的影响 在30mL不含碳源的发酵培养基中加入2%的上述不同碳源，保持其它成分不变，在相同接种量（10%）相同培养条件下（37℃，72h，200rpm）摇瓶发酵，测定酶活。 （二）碳源对发酵产酶的影响 2、碳源浓度对发酵产酶的影响 ——单因子分析 选取其中效果最明显的一种作为碳源，分别以0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%和3%的浓度添加到不含碳源的发酵培养基中，在相同接种量（10%）相同培养条件下（37℃，72h，200rpm）摇瓶发酵，测定酶活。 （三）氮源对发酵产酶的影响 1、氮源种类对发酵产酶的影响 在30 mL不含氮源发酵培养基中加入1.5%的上述不同氮源（无机和有机氮源），保持其它成分不变，在相同接种量、相同培养条件下（37℃，72h，200rpm）摇瓶发酵，测定酶活。 （三）氮源对发酵产酶的影响 2、氮源浓度对发酵产酶的影响 ——单因子分析 选取其中效果最明显的一种作为氮源，分别以0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%和3%的浓度添加到不含碳源的发酵培养基中，在相同接种量、相同培养条件下摇瓶发酵72h ，测定酶活。 （四）装液量对产酶的影响 在250 mL三角瓶中分别装20mL、30mL、40mL、50mL、60mL和70mL的培养基，在相同接种量（10%）相同培养条件下（37℃，72h，200rpm）摇瓶发酵，测定酶活。 （五）接种量对产酶的影响 分别以6%、8%、10%、12%、14%和16%的接种量接种淀粉酶产生菌于30mL的发酵培养基中，在相同的培养条件下（37℃，72h，200rpm）摇瓶发酵，测定酶活。 （六）培养基pH对产酶的影响 接种淀粉酶产生菌于pH分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0的30 mL的发酵培养基中，在相同接种量（10%）、相同培养条件下（37℃，72h，200rpm）摇瓶发酵，测定酶活。 （七）正交实验 1、选取其中对酶活性影响较大的四个因素，如碳源浓度、氮源浓度、接种量和pH 值；每个因素选三个水平（水平即在因素的允许变化范围内，要进行试验的 “ 点 ” ）。 表1 3水平4因素 水平 / 因素 A 碳源（%） B 氮源（%） C 接种量（mL） D pH 1 1.5 0.5 2 5 2 2 1.