温与气单胞菌毒力基因的检测及对鲫鱼致病性试验.pdfVIP

动物医学进展 。2015，36(3)：17—20 ProgressinVeterinaryMedicine 温和气单胞菌毒力基 因的检测及其对鲫鱼致病性试验 王海娟 ，王 利 (1．西南民族大学青藏高原研究院，四川成都 610041；2．西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 61O041) 摘 要：为探究温和气单胞茵菌株 A．s1的致病性 ，采用PCR方法扩增溶血素基 因(hly)、细胞兴奋性 肠毒素基 因(alt)、黏附素基 因(aha1)和气溶素基因(aerA)4种毒力基 因，并运用动物 回归试验探究菌株 A． S1对鲫鱼的致病性 。结果表 明，菌株 A．s1可扩增 出hly、ahal和 a1t3种毒力基 因，未扩增 出aerA基 因。 动物回归试验显示，试验组鲫鱼在腹腔注射温和气单胞茵0．3mL(浓度为 1．5×10 CFU／mL)后 ，5d内死 亡率达 100 。表 明毒力基因型为hly 、ahal 、alt。。和aerA一的菌株A．S1为高毒力菌株，且菌株的毒力基 因型与致病性呈正相关 。 关键词：温和气单胞茵；毒力基 因；致病性 中图分类号 ：$852．612 文献标识码 ：A 文章编号 ：1O07—5O38(2O15)O3一O017一O4 温和气单胞菌(Aeromonassobria)属弧菌科 、气 校动物遗传育种学 国家 民委一教育部重点实验室低 单胞菌属 ，是一种人、鱼和其他动物共患的条件性致 温保存备用 。 病菌 ，可引起人类 患细菌性腹膜炎、菌血症 、软组织 1．1．2 主要试剂及仪器 普通营养琼脂 ，杭州微生 坏死 、急性肠 胃炎、阑尾 炎 、坏死性 筋膜 炎等疾 物试剂有限公司产品；DNAMarkerDL2000，宝生 病 [1]，同时也可感染多种鱼类 。目前 已从鲈鱼 、日 物工程 (大连)有 限公司产 品；细菌基 因组 DNA提 本鳗鲡 、罗非鱼 、中华鳖_4]、黄颡鱼等分离鉴定出该 取试剂盒和 2×TaqPCRMasterMix，天根生化科 菌。温和气单胞菌致病株 的毒力与其产生 的溶血 技 (北京)有限公司产品；PCR仪 ，Eppendorf公司产 素、肠毒素、细胞毒素及胞外酶等多种重要的致病 因 品；凝胶成像系统 ，Bio-Rad公司产品。 子有关 。当条件适宜时，该菌生长迅速 ，繁殖较快， 1．2 方法 其产生的毒素可引起机体复杂多样 的病理变化 。 1．2．1 制备 DNA模板 将超低温保存 的温和气 鲫鱼 (Cruciancarp)是我 国水产养殖 中最常见 单胞菌菌株快速复苏，接种于 LB液体培养基 ，28℃ 淡水鱼类 。近年来 ，随着水体恶化 、养殖集约化等现 培养过夜 ，简短离心，采用细菌基 因组 DNA提取试 象 ，细菌性疾病屡次发生 ，对鲫鱼及整个水产养殖业 剂盒提取细菌的总 DNA，置一20℃保存备用。 造成 了严重的经济损失 ，对人类的健康构成了潜在 1．2．2 引物设计 根据 GenBank数据库中的毒力 的威 胁 。弗 氏柠 檬 酸杆 菌 (Citrobacter P72一 基因序列 ，利用 Primer5．0软件设计温和气单胞菌 dii)]、迟钝爱德华菌 (Edwardsiellatarda)、沙 门 4种主要毒力因子溶血素基 因(hly)、细胞兴奋性肠 菌 (Salmonella)等相继从发病鲫鱼体 内分离 出，但 毒素基 因(alt)、黏 附素基 因(aha1)和气溶素基 因 尚未见温和气单胞菌对鲫鱼致病性研究的报道。本 (aerA)的引物 。引物序列见表 1，引物 由上海生工 试验采用 PCR方法对温和气单胞菌菌株 A．S1进 生物工程技术服务有限公司合成 。 行毒力基因检测 ，同时人工回归感染鲫鱼 ，旨在为进 1．2．3 毒力基 因扩增 采用 PCR方法对 4种主要 一 步研究温和气单胞菌在鱼类 中的致病机制提供科 毒力基 因进 行扩增 ，反应体 系 (20 L)：ddHO 学资料 。