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《核酸的酚抽提》实验报告.doc
《核酸的酚抽提》实验报告
实验原理
在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动物基因组DNA，用此方法得到的DNA长度为100～150kb,适用于λ噬菌体构建基因组文库和Southern印迹分析。
实验试剂
1. 5mol/L NaCl；0.5mol/L Tris-Cl，pH8.0；0.5mol/L EDTA，pH8.0；3mol/L NaAc，pH 5.2；分别进行高压灭菌。
2. 蛋白酶K：10mg/mL，配好后用一次性过滤器过滤，-20℃保存。
3. 组织匀浆液：100mmol/L NaCl,10mmol/L Tris-Cl(pH8.0),25mmol/L EDTA(pH8.0)。
4. 酶解液：200mmol/L NaCl,20mmol/L Tris-Cl(pH8.0),50mmol/L EDTA(pH8.0),200μg/mL蛋白酶K，1%SDS。
5. 无DNA酶的RNA酶：将胰RNA酶溶于10mmol/L Tris-Cl(pH7.5)、15mmol/L NaCl溶液中，浓度10mg/mL，于100℃水浴处理15min以破坏DNA酶，缓慢冷却到室温，-20℃保存。
6. TE缓冲液：10mmol/L Tris-Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)。
7. 平衡酚(pH8.0)∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1(体积比)。
8. 氯仿∶异戊醇=24∶1(体积比)。
实验步骤
1. 取0.2g鼠肝，用冰冷的生理盐水洗3次后置于2.0mL匀浆液中，在冰浴中用玻璃匀浆器匀浆至无明显组织块存在，但勿将细胞破碎。
2. 将冰冷的匀浆液移至1.5mL离心管中，5000r/m离心30～60s，弃上清。沉淀加0.8mL无菌水迅速吹散，分两管，再加0.4mL酶解液，缓慢翻转混匀，55℃水浴处理12～18h。
3. 沉淀加RNase至终浓度200μg/mL,37℃水浴1h。
4. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇缓慢旋转混匀，冰浴冷却，10000r/m离心10min。含DNA的水相一般在上层，中间为蛋白质沉淀，下层为有机相，但DNA浓度过高时，含DNA的水相会在下层，要注意观察判断。
5. 用扩口吸管移出含DNA的水相，加等体积氯仿/异戊醇，冰浴预冷，10000r/m离心10min，若界面或水相中蛋白含量多，可重复4，5操作。
6. 用扩口吸管小心吸出上层含DNA的水相，加1/10体积的NaAc，小心充分混匀，再向每管中加入2.5倍体积的无水乙醇，-20℃过液。
7. 12000r/m离心15min，弃上清，75%冷乙醇洗涤一次，12000r/m离心15min，室温干燥(不要太干，否则DNA不易溶解)，加入适量TE缓冲液，存放于4℃，轻摇溶解过夜，即可得实验用动物基因组DNA。
注意事项
1、记住离心管编号。
2、在离心管平衡后，对称放入离心机，切忌将没加管套的离心管放入离心机，离心完后取出离心管。
避免液体洒在离心机上面或钻头上。
启动离心机后，离心机如有不正常反应或噪音，应立即停止离心，并分析原因。
各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解 取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰.
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