DNA重组、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化.docVIP

DNA重组DNA重组DNA重组（基因重组）由不同DNA链的断裂和连接而产生DNA片段的交换和重新组合，形成新DNA分子的过程。原核生物的基因重组有转化、转导和接合等方式。受体细胞直接吸收来自供体细胞的DNA片段，并使它整合到自己的基因组中，从而获得供体细胞部分遗传性状的现象，称为转化。通过噬菌体媒介，将供体细胞DNA片段带进受体细胞中，使后者获得前者的部分遗传性状的现象，称为转导。自然界中转导现象较普遍，可能是低等生物进化过程中产生新的基因组合的一种基本方式。高等动植物中的基因重组通常在有性生殖过程中进行，即在性细胞成熟时发生减数分裂时同源染色体的部分遗传物质可实现交换，导致基因重组。基因重组是杂交育种的生物学基础，对生物圈的繁荣昌盛起重要作用，也是基因工程中的关键性内容。基因工程的特点是基因体外重组，即在离体条件下对DNA分子切割并将其与载体DNA分子连接，得到重组DNA。1977年美国科学家首次用重组的人长激素释放抑制因子基因生产人生长激素释放抑制因子获得成功。此后，运用基因重组技术生产医药上重要的药物以及在农牧业育种等领域中取得了很多成果。）））、vector及重组DNA片段等，并, 建立连接反应。 成分 体积 vector 0.5μl 纯化产物 4.5μl Total 5μl 注：纯化产物的使用量——0.1pmol-0.3pmol； 3、 加入Solution Il，感受态细胞50μl + 重组DNA5μl）重组DNA质粒解冻后，混匀，瞬间离心再取； 3）含量50ng，体积不超过10μl 4）混重组克隆的Amp抗生素1ml液体LB培养基中，37度培养过夜（转速200转/分）。 3、菌落PCR 1）菌液模板的获取 取0.2ml过夜培养的菌液于1.5ml离心管中，沸水浴5分钟。000rpm，离心3分钟。 2）配制PCR体系——25μl 模板：取2μl上清作为模板； 引物：pGE-T Vector 多克隆位点两侧的序列； 或从基因组中扩增出片段时所用的引物。 反应体系： 组分（工作浓度） 体积 终浓度 10×Buffer 2.5μl 1× dNTP(10mM) 0.5μl 200μM 引物（上下游2.5μM） 2μl 0.2μM 菌液 2μl 100ng Taq(5U/μl) 0.25μl 1.25U 灭菌ddH2O 补齐25μl 3）PCR反应条件 94℃ 预变性2 分钟 ↓ 94℃ 变性30 秒 57℃ 退火30 秒 28 cycles 72℃ 延伸30秒 ↓ 72℃ 延伸5分钟 4）电泳 取10μl PCR产物，加入上样缓冲液，1.5%琼脂糖电泳检测插入片段的大小是否与目的基因一致。 质粒DNA的提取酶切电泳检测质粒DNA的提取限制性内切酶能特异地结合限制性酶识别的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 　　5…G↓AATTC…3 → 5… G AATTC…3 　　3…CTTAA↑G 5 → 3… CTTAA G…5 酶切反应影响因素　　DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响酶切反应的效率。DNA：大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。 　　酶切图谱DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。 　　在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般DNA用量约为0.5-1μg。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37℃)。对质粒DNA酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶,消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2-3倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。 ml