环境微生物生态的研究方法进展.pdfVIP

环境微生物生态研究方法进展 谢冰徐亚同 (华东师范大学环境科学与技术系，上海200062) 16S 关键词：微生物分子生物学分子杂交PCR rRNA凝肢电泳微生物醌 1概 述 微生物生态学的研究可以分析确定微生物的量，群体结构和活性，对于保护和改善生态环 境、构建人工生态系统、提高废水生物处理的效率有着重要的科学意义和使用价值。传统的 微生物生态学研究是基于微生物的直接培养来分析环境中微生物的种群结构及其生态关系 的，由于自然界中可培养微生物数量只占到实际微生物数量的不到10％，传统方法显然不 适合微生物群体结构研究。以遗传标记或生物特征化合物为标记的现代分子生物学的发展 产生推动了微生物分子生态学的发展，与传统微生物分析方法相比，微生物分子生态学不经 过分离培养技术而直接对环境微生物进行分析，为环境微生物的生态研究打开了一扇分子 生物学的大门，在环境微生物生态分析中引进分子生物学技术进行研究是目前国外相关研 究的热点。我国的研究才刚刚起步。 环境微生物的研究中采用的分子生物学的研究方法主要包括核酸分子杂交技术、PCR 技术、同源性分析法、梯度凝胶电泳方法、生物醌谱图法等。下面分别介绍。 2核酸分子杂交技术 核酸分子杂交技术是20世纪70年代发展起来的一种崭新的分子生物学技术，它是基于 DNA分子碱基互补配对的原理，用特异性的cDNA探针与待测样品的DNA或RNA形成杂 交分子的过程。根据所用的探针和靶核酸的不同，杂交可分为DNA-DNA杂交、DNA-RNA 杂交、RNA-RNA杂交三类。由于它的高度特异性和灵敏性，近年来被广泛地应用于微生物 生态学的研究中。 标记核酸探针技术可直接用来探测溶液中或膜上或细胞组织内的同源核酸序列，杂交 方式可以是菌落杂交、狭缝杂交或原位杂交。 核酸杂交技术可以快速检测出环境微生物中独特的核酸序列，可对有关微生物在特定 环境中的存在与否、分布模式和丰度等情况进行研究。如果用光密度测定法可直接杂交得 到的阳性结果并定量。如对活性污泥中的特定微生物的生长速率进行测定，将放射性标记 的胸腺嘧啶投加到活性污泥的系统中，使细菌在分裂时参人标记，用特定细菌的核苷酸探针 固定在杂交膜上，用活性污泥总DNA进行杂交，根据放射性强度可以定量分析特定细菌的 DNA量。在对被石油污染的土壤分析中，用核酸杂交法得到某种烃降解基因的检出率显著 116口生态安垒与生态t设 高于不污染样品，定量分析结果表明，污染越严重，这种降解基因的含量也越高，可用该方法 作为土壤中石油污染程度的评价。 目前环境微生物研究中应用较多的是原位杂交技术。环境样品直接作原位杂交(i。 situ hybridization)，可获得未知菌的微生物多样性的大量信息，如微生物的形态特征和丰度 以及在样品上的空间分布和动态，原位杂交技术能有效对环境微生物样品进行定量。如 Jain等采用特异性的探针对地下水中的细菌进行原位杂交，研究细菌有关质粒基因的存在 和分布情况。 insitu 在核酸原位杂交技术中，荧光原位杂交技术(fluorescent 应用较为广泛的技术之一，FISH技术利用带有荧光标记的探针与固定在玻片或纤维膜上的 组织或细胞中特定的核苷酸序列进行杂交，无需单独分离出DNA或RNA，探测其中所具有 的同源核酸序列，结果可直接在荧光显微镜下观察。探测的灵敏度可达到10～20个mR． NA拷贝／细胞。对于自然界、反应器系统或实验室富集培养基中的样品，与带有荧光标记 的寡聚核苷酸探针杂交。根据探针序列的不同，特异性探针与相应的靶核糖体结合，能鉴定 到科、属、种。特别是对硝化细菌的研究中，FISH技术被广泛地应用。GulnurCoskuner利 用FISH技术对活性污泥中的硝化细菌进行鉴定和计数，避免了传统的、用培养方法计数带 来的偏差。他们认为FISH技术能揭示更多硝化细菌的微生物学方面的信息及它们种群的 大小，更有利于提高、改进生物脱氮系统的工艺。开发的对硝化细菌快速定量检测的方法， 只需要3天，实验的结果与理论是完全吻合的。利用荧光共焦显微镜可对活性污泥中的氨 氧化菌在絮体中的空间分布进行分析。Voytek等研究了3种检测Bonney湖中硝化细菌丰 用于鉴定Proteobacteria B和7亚属的氨氧化菌。IFA和FISH用于检测氨氧化菌的相对丰 度。他们利用FISH技术得到的数据与通过化学方法检测的