犬瘟热病毒和细小病毒双重PCR检测方法的建立及初步应用.pdfVIP

犬瘟热病毒和细小病毒双重PCR检测方法的建立及初步应用 张洪亮，王怡男，王聪，靳继惠，刘林，单虎· (青岛农业大学，山东省预防兽医学重点实验室，山东青岛，266109) 法进行了对比试验。结果表明，建立的双重PCR方法特异性强、敏感性高，可扩增出5．63ng的总核酸量；与试纸条方法相 中CDV和CPV／MEV的混合感染。 关键词：犬瘟热病毒；细小病毒；双重PCR；检测 犬瘟热病毒(Canine distempervirus，CDV)是引起犬科、鼬科及一部分浣熊科或其它食肉目动物犬 瘟热(Caninedistemper，CO)的病原u’引。犬细小病毒(Canine enteritis CPV、托V常在宠物犬和毛皮动物(水貂、貉、狐狸)上发生混合感染H’引，在已免疫群体中症状往往不典型， 难以从临床症状上做出准确的诊断。多重PCR方法能对多种疾病进行同步诊断，缩短了检测时间∞’“。目前 有关于同时检测CDV和犬冠状病毒(Canine 了CDV和CPV／MEV双重PCR检测方法。 1材料与方法 1．1 材料 1．1．1毒株和样品犬瘟热疫苗CDV3株、MEV山东分离株由青岛农业大学山东省预防兽医学重点实验室保 存：犬五联(狂犬病、犬瘟热、副流感、腺病毒病、细小病毒病)活疫苗由吉林省五星动物保健药厂生产 PUPPY 烟台、威海等地的动物医院和毛皮动物养殖场送检，无菌采集脑、肝、肺、脾以及膀胱等脏器，一70℃保存 备用。 Plus、Reverse XL(AMv)、 1．1．2主要试剂DNAzolRegent购自Invitrogen公司：RNAisotranscriptase Ribonuclease DNA Inhibitor、dNTP、rTaqpolymerase、DNA 公司；CDV、CPV胶体金检测试纸条购自韩国Bioindist 夷实业有限公司：GoldView(GV)购自北京赛百盛基因技术有限公司。 1．2方法 1．2．1 MEV结构蛋白VP2的核酸序列，选定基因的相对保守区。利用Oli907．37软件，根据CDV 和CPV 异性引物P3／P4(见表1)。引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成，用RNase—free水稀释到10pmol／“L， 一20℃保存备用。 基金资助：山东省自然科学基金ZR2010CL023；科技基础性工作专项(2012FYlll000) 通讯作者：单虎．男．博士，教授，主要从事动物传染病防治和生物制品研究，E-mail：shanhu67@163．com ·--——463·-——— 第四届中国兽药大会——兽医微生物学、兽医生物制品学学术论坛论文集(2012年) 表1引物序列 Tablel ofthe Sequenceprimers 8序列在CDV Onderstepoort株(AF305419)全基因组中的位置。6序列在CPV 中的位置。 000u／IIlL)，剪碎， 1．2．2样品与病料处理剪取5．0g组织病料，加少量灭菌PBS(含青霉素、链霉素各1 000 用无菌研磨器研磨至糊状，再用PBS按l：4的体积比稀释成悬液，反复冻融3次，10rpm离心5min， 取上清(病毒悬液)，一70oC保存备用。 1．2．3核酸提取采用TaKaRa公司的RNAisoPlus试剂按提取样品中Total 的DNAZol试剂提取样品中TotalDNA。操作步骤参照试剂说明书。 1．2．4CDV RNA，采用20虬的体