透射电镜样本的制备.pptVIP

判断切片厚度：利用切片反射的光和从切片下水面反射光发生干涉，不同厚度切片在显微镜下呈现不同的干涉色，干涉色与切厚度的关系是： 灰色 40-50nm 分辨率高，反差小 银白色 50-70nm 金黄色 70-90nm 分辨率低，反差好 紫色 90nm以上 电子束不易穿过 FORMVAR膜制备 Formvar（PVF）溶于纯二氯乙烯制成0.2-0.5%的制膜液 染色 组织细胞的成分主要由碳、氢、氧、氮等低原子序数的元素组成，不能形成足够的反差。 利用重金属离子对不同细胞结构的结合能力不同，使各细胞结构对电子产生不同散射程 度以增强反差。 染色剂 30min左右 与CO2接触会形成不溶性碳酸铅沉淀 10min左右 半薄切片制作 可进行定位，克服超薄切片盲目性，提高电镜观察的效果。 修块时，将切片修得大一些，切成1μm的厚片，甲苯胺蓝染色观察。 超薄切片制样程序 2-3%戊二醛固定液中 4℃，2小时或更长时间。 磷酸缓冲液漂洗 3次，每次15min。 1%锇酸 2h 磷酸缓冲液漂洗 3次，每次15min。（可4℃过夜） 取材：处死实验动物后半分钟到1分钟内，最多15分钟取出1mm3的组织块 固定： 50%丙酮 15min 70%丙酮 15min 90%丙酮 15min 100%丙酮 2次，每次20min 脱水： 100%丙酮：Epon812=2:1 1h; 100%丙酮：Epon812=1:1 1h 100%丙酮：Epon812=1:2 1h 纯Epon812 2-4h 浸透： Epon812包埋剂 35℃过夜 Epon812包埋剂 45℃24h Epon812包埋剂 60℃24h 包埋： 5%醋酸铀 30min-1h。 双蒸水洗 3 次 柠檬酸铅染色 5-10min 双蒸水洗 3 次 超薄切片：包埋块修整成四边光滑尖端呈梯形面的锥体，切成50-70nm的超薄切片。 切片染色： 负染 阴性染色，是相对于普通染色（称正染色）而言。首先由hall在1955年提出。 Hall在病毒研究中用磷钨酸染色后，发现图像的背景很暗，而病毒象一个亮晶的空洞被清楚地显示出来。在超薄切片的染色中，染色后的样品电子密度因染色而被加强，在图像中呈现黑色。而背景因未被染色而呈光亮，这种染色称为正染色。而负染色则相反，由于染液中某些电子密度高的物质(如重金属盐等)包埋低电子密度的样品，结果在图像中背景是黑暗的，而样品像透明地光亮。两者之间的反差正好相反，故称为负染色 负染 简单快速 可显示生物大分子、细菌、分离的细胞器以及蛋白晶体等样品的形态、结构、大小及表面结构的特征。 病毒 负染染色剂的条件 较强的电子散射能力以产生足够的图像反差。 熔点高，在电子束的轰击下不会升华 溶解度大，不易析出沉淀。 在电镜下不呈现可观察到的结构。 分子小，容易渗入不规则表的凹陷处 与样品不起化学反应。 目前常用的负染液：磷钨酸，磷钨酸钾，磷钨酸钠。磷钨酸、磷钨酸钠、磷钨酸钾溶液通常用双蒸水或磷酸缓冲液配制成1％～3％的溶液，使用时应用1 mol／L氢氧化钠溶液将负染色液的pH值调至6.4～7.0或实验所需的值。 样品要求 样品要适当提纯。不要求样品悬液的纯度很高，但杂质过多，如大量的细胞碎片，培养基残渣，糖类及各种盐类结晶的存在会干扰染色反应和电镜的观察。 样品悬液浓度适中，太稀不易找到样品，太浓样品堆积影响观察。 负染染色方法 悬滴法：悬滴法 用一根细滴吸管吸一滴样品悬液滴在有膜的铜网上，滴样时要防止铜网被液体吸到管上来或翻转而被污染。滴液后静置数分钟，然后用滤纸从铜网边缘吸去多余的液体，滴上负染色液，染色1～2分钟用滤纸吸去负染色液，再用蒸馏水滴在铜网上洗1～2次，用滤纸吸去水，待干后可用于电镜观察。 喷雾法： 将染色液和悬液样品等量混合，用特制的喷雾器喷到有膜的铜网上，待干后可用于电镜观察。喷雾法的优点是雾滴较小，分布均匀，不易凝结成块。但操作较麻烦，溶液混合时易产生沉淀，并且需要耗费较多的样品和染色液，尤其容易造成病毒扩散，故此法不常用。 漂浮法 ：先将带有支持膜的铜网在悬液样品的液滴上漂浮(有支持膜的那面向下)，然后再在负染色液的液滴上漂浮。在漂浮期间，样品和染色液被吸附在铜网的支持膜上，漂浮时间与悬滴法相近。 复习题 简述超薄切片制样步骤 负染 透射电镜样本的制备 超薄切片制样 负染 超薄切片 由于电子的穿透能力弱，一般的组织细胞的切片，无法在电镜下获得清晰的图像。阻碍了电子显微镜的发展。 1957年，英国Huxley发明超薄切片机。 超薄切片制片过程 取材 取材具体方法 将动物麻醉或急性处死，暴露的所需脏器。 用锋利剪刀剪下一小块组织，放到滴有预冷固定液的蜡片上。 将组织切成细长条，再将其切成小块（1mm3）。 将小块移至装有预冷固定液的清