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血清碱性磷酸酶活性测定 磷酸苯二钠法 小组成员： 程展鹏，杨秋月，陈敬根，卢昆 实验目的 熟悉酶活性测定方法的一般原理 掌握血清ALP测定原理与临床意义 实验原理 在PH10 环境中，ALP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠，苯酚与4-氨基安替比林反应生成色素原，该色素原经铁氰化钾氧化生成红色醌亚衍生物。测定红色物质的吸光度就可以计算酶活性的大小。 反应式如下： ALP磷酸苯二钠+H2O——苯酚+磷酸氢二钠 pH10 铁氰化钾 苯酚+4-氨基安替比林————红色醌亚胺衍生物 实验器材和试剂： （一）器材：5ml移液管，1ml移液管，100或200ul微量可调式移液器，721E分光光度计，1cm比色皿，37℃ 恒温水浴 （二）试剂： 1．0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH10.0) 称取无水碳酸钠6.36g，碳酸氢钠3.36g，4-氨基安替比林1.5g，加蒸馏水溶解至1000ml。置棕色瓶中保存。 2．20mmol/L磷酸苯二钠溶液 先将400ml蒸馏水煮沸，称取磷酸苯二钠2.18g(磷酸苯二钠如含2分子结晶水，则应称取2.54g)加入煮沸的蒸馏水中使其溶解，冷却后用煮过的冷蒸馏水加至500ml，再加氯仿2ml，置冰箱保存，此为底物溶液。 3．铁氰化钾的硼酸溶液 称取铁氰化钾2.5g，硼酸17g，各自溶于蒸馏水400ml中，两液混合后，加蒸馏水至1 000ml，置棕色瓶中避光保存(如出现蓝绿色即弃去)。 4．酚标准工作液（0. 05mg/ml）：购买合格的二级标准品。 实验操作 取试管4支，按下表操作： 立即混匀。用510nm波长比色，以蒸馏水调零点，读取各管吸光度。 计算 ALP活性=（A测定—A对照）/（A标准—A空白）*0.05*100(金氏单位） 标准曲线法 制备如下： 取试管6支，分别加酚标准液(1ml=0．1mg)，0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4ml，各管依次加复合基质液3.1、3.05、3.0、2.9、2.8、2.7ml。混匀后37℃水浴保温5分钟，各管加入1.0ml碱性溶液，再加0.5％铁氰化钾2.0ml，立即混匀。静置10分钟，510nm波长下比色。将以上各管所得读数与其相应的碱性磷酸酶单位(依次为0.5、10、20、30、40单位)在坐标纸上作图，绘制成标准曲线。 临床意义 在临床上，血清ALP测定常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临床辅助诊断指标。 1．血清ALP活性升高 ： 肝胆疾病：阻塞性黄疸、急性或慢性黄疸性肝炎、肝癌等；骨骼疾病：由于骨的损伤或疾病使成骨细胞内所含高浓度的ALP释放进入血液中，引起血清ALP活性增高，如纤维性骨炎、成骨不全症、佝偻病、骨软化病、骨转移癌和骨折修复愈合期等。 2．血清ALP活性降低： 比较少见，主要见于呆小病，ALP过少症，维生素C缺乏症。 注意事项 1．底物溶液中不应含有游离酚，如有酚则空白管显红色，说明磷酸苯二钠已经开始分解，应弃去不用。 2．铁氰化钾溶液中加入硼酸有稳定显色作用。该液应避光保存，如出现蓝绿色即应废弃。 3．加入铁氰化钾溶液后必须立即混匀，否则显色不完全。 * 0.100 —— ——— —— 血清 3.00 3.00 3.00 3.00 铁氰化钾溶液 混匀37摄制度水浴保护15min 1.00 1.00 1.00 1.00 底物液 混匀37摄氏度水浴保温5MIN同时将底物预热 1.00 1.00 1.00 1.00 pH10碳酸盐缓冲液 —— 0.100 —— —— 蒸馏水 —— —— 0.100 —— 酚标准液 —— —— —— 0.100 血清（ml） 对照管 空白管 标准管 测定管 *