问题分析对付策略---PCR常见问题分析与对策.docVIP

PCR常见问题分析与对策 PCR产物的电泳检测时间 48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，?④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。 Taq酶或溴乙锭。 PCR失败或扩增条带不?理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单?位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有?引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条?带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条?亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融?或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不?够，引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。 PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出?现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影?响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下?扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。 PCR扩增是不会成功的。 PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。 PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。  　　靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交?叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。  　　PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数?过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶?则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引?物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次?数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。  　　PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少循环次数。 PCR/RT-PCR疑难问题解答 1.问题：RT-PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。  1）RNA被降解  ????在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA； 100％甲酰胺中储存RNA； RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8mM?DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。 2）RNA中包含逆转录抑制剂  ????通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元（0.25μg到0.4μg/μl）以帮助小量样品RNA的恢复。 SDS，EDTA，甘油