猪α干扰素的原核表达及抗高致病性猪繁殖和呼吸综合征病毒活性测定.pdfVIP

第三届猪病防控学术研讨会会议论文集 猪瑾干扰素的原核表达及 抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒活性测定 张志凌·，闰若潜，赵明军，刘光辉，赵雪丽，盛敏。吴志明 (河南省动物疫病预防控制中心， 河南 郑州450008) 摘要为了研究高效广谱的基因工程抗病毒制荆，本研究设计引物自猪肝脏总DNA扩增、克隆猪Ⅱ干扰素 尿素变性，低浓度蛋白复性液复性，PBS溶液透析等步骤进行纯化，采用细胞病变抑制法分别测定rPolFN．q蛋白在 and reproductiverespiratorysyndrome 表达的rPolFN-u蛋白分子量大小20．7Ku左右，与预期大小相一致：经纯化后的蛋白纯度在95％以上；纯化的 rPolFN吨蛋白在PKl5细胞上抗VSV病毒活性单位为1．4482x104IU／mL【5．2x106 IU／mg)，在Mare．145细胞上能 完全抑制高致病性PRRSV增殖所需的rPolFN吨蛋白最低有效量为640U／mL(2．3x104 U／mg)．本研究成功表达了 具有抗病毒活性的PoⅡN吨蛋白，这些研究为新型基因工程抗病毒制剂的开发以及高致病性猪繁殖与呼吸综合征等 病毒性疾病的预防和治疗奠定了基础． 关键词猪Q干扰素、表达．纯化、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒，抗病毒活性 细胞因子，干扰素与细胞表面特殊的受体结合而发挥其抗病毒的DNA和RNA合成的作用．包括对 某些酶的诱导作用、阻止受感染的细缒中病毒的复制、掷制细胞繁殖等。干扰素分为I型和li型两 大类，II型干扰素只有IFN-y，其主要作用是免疫调节作用；l型干扰素分为五个亚型种类，其中 IFN吨是一个大家族。机体内产生的IFN吨是病毒诱导白细胞产生的，其主要功能为抑制病毒繁殖、 抗肿瘤、通过增强NK细胞杀伤病毒感染细胞的能力从而抑制病毒的增殖和扩散、增强机体细胞免 抗病毒生物制品而广泛应用于临床。 当前，以高致病性PRRS为主的猪的病毒性疾病对养猪业危害严重。目前尚未有好的药物可以防 治；IFN吨具有广谱的抗病毒活性，而且无残留、无副作用，不会对人类健康造成危害，已成为替代 化学合成抗病毒药物的理想新药。为了开发低成本、高活性、易于生产的基因工程重组猪Or,干扰素 (rPoIFN吨)蛋白制剂来预防和治疗猪的病毒性疾病，本研究将对PoIFN啦成熟肽基因进行克隆、表 达、纯化，对纯化后的rPolFN-a蛋自迸行抗永泡性口炎病毒(VSV)活性测定以确定干扰素活性单 位，并进一步评价rPoIFN—a蛋白在Marc—145细胞上抑制高致病性PRRSV的增殖活性。 l材科和方法 1．1主要仪器和试剂 lnnotech公司产品：II级 梯度PCR仪为德国Biometra公司产品；凝胶成像分析系统为美[虱Alpha 达载体由本实验室保存。低浓度蛋白复性缓冲液由本实验室自行配制。主要成分为NaCl／Tris．HCI、 蛋白水解酶抑制剂、氧化还原裁等， I．2病毒 高致病性PRRSV 12445)相应基因片段核苷酸 其NSP2(AB359239)与我国分离的高致病性PRRSV标准株JXAI(EFI 12445)相应的基因序列核苷 连续缺失：编码其E／M／N蛋白的基因序列(AB359235)与JXA!株(EFl 酸序列同源率为99．9％。vsv由河南农业大学动物医学院微生物教研室惠赠。 ‘弧恚凌(1964一)。女。河南新乡入，研究员，研究方商：动物疫病防控技寒研究 病毒病 1．3 PolFN-a基因的PCR扩增 I和Hind 板设计一对两端分别含Sph III酶切位点的表达引物对EPI／EP2：以猪肝脏总DNA为模板进行 PCR反应程序为940C热变性5min后，940C45see、