猪干扰素的原核表达、纯化和抗病毒活性的检测.pdfVIP

其他论文 而且HSP70的高水平维持时间也越长．--f，x将淋巴细胞HSP70作为仔猪冷应激的分子生物标志． 关键词仔猪；冷应激；激素；HSP70 猪干扰素的原核表达、纯化及抗病毒活性的检测 李树民 (军事医学科学院军事兽医研究所 吉林长春 130062) 摘要方法：为了研究高效广谱的基因工程抗病毒截荆，本研究使用全基因合成方法，合成了编码猪干扰素成熟肽 的基因全序列，并克隆入pET28a载体中进行原核表达，使用原核细胞发酵罐对表达菌株扩大培养，表达融合重组 猪干扰素蛋白。对蛋白进行变性、复性和脱盐处理，采用病变抑制法测定rPIFN在PKl5细胞上抗VSV病毒的增殖 活性．结果：合成的基因全长501bp，编码166个氨基酸：表达的蛋白分子量为2万Da左右，与预期的大小一致． 使用15升的发酵罐，高密度发酵，培养工程茵的密度可达到100克／L湿茸．每克可获得0．5毫克纯品rPIFN．经纯 达和纯化了rPIFN蛋白，生产成泰低廉，为开发治疗猪的病毒病高效生物制剂打下了基础． 年相继发现免疫活性细胞经丝裂原或抗原刺激后，产生一类对酸敏感的干扰素。称为免疫干扰素。 目前依据干扰素对酸的敏感性通常分为I型干扰素(酸敏感型)和u型干扰素(耐酸型)两类。几 乎所有脊椎动物均可产生这两类干扰素，根据产生干扰素细胞种类不同，I型干扰素至今已发现 2003)。 INF-a、B、∞、，c、t、6等6种类型，而II型干扰素迄今为止仅发现M吖一种(Domeika， 干扰素具广谱、高效抗病毒功能，及其对免疫系统起关键调节作用，因此成为当今免疫学、遗传学 和分子生物学研究最为活跃的领域之一。 本项目选择的是猪的INF-y，其具有比活性高，副作用小 的特点。 1材料和方法 1．1主要仪器和试剂 PCR仪器为博日公司产品，凝胶成像仪为北京六一仪器厂产品，超净工作台为哈东联公司产品， 高压均质机为上海东华均质机厂产品，基因克隆等分生试剂均购自大连宝生物有限公司；大肠杆菌 BL21(DE3)本室保存，VSV和PKl5细胞为本室保存。 1．2 rPIFN的基因克隆、表达 参照GENEBANK已经公布的序列两端分别设计了两个酶切位点Ncol和EcoRI位点。将其插 入表达载体pET28a中，筛选阳性重组质粒送宝生物工程有限公司测序。将构建好的重组质粒转化至 继续培养3小时。加空菌和表达菌，用SDS．PAGE分析表达产物。 1．3工程菌的发酵 至终浓度到1molFL继续培养3小时。在发酵过程中氧气供应由正气泵以小于10psig的压力充以空气， 糖和碱的需要量由仪器自动控制。糖为20％葡萄糖。碱为氨水。 1．4 yPIFN的复性与纯化 Tris． 以5000r／min离心收集发酵后的rPIFN．pET28a／BL21(DE3)工程菌，用TE(50mmol／L 第=届猪病防控学术研讨会会谈论史摹 50mmo[／LTns．Immol／L ／min离心收集沉淀，再位_}}j EDTA，2M脲洗椽包涵体2次，离心收集 包涵体沉淀。使用8M屎素溶解变性沉淀。运渐稀释到一定的尿素浓度为6mot／L：目的蛋白复性率 选50％以上，复性后蛋白具有较高的生物学活性。在包涵体溶解复性液中加^硫酸铵至终浓度为 6mol，L尿素．2M硫酸铵．BufferB为25raM Tris-HC[，pH$，2moFL尿素，上疏水层析柱Phenyl B组成线性梯度洗脱．形成尿素浓度线性梯度．变性蛋白质随着尿素浓度的降低而逐渐复性，同时 随着硫酸铵浓度的降低，复性后的蛋白质被洗脱下来 收集的洗脱峰经透析、离心处理后．得复性 Performance进行纯化．BufferA为 后的蛋白质样品。复性后使用离子交抉层柝QSephare6eHigll 20mM PB．邮，4，0 PB，pH74．BufferB为