Lentivirus介导表达多基因人胚基因工程神经干细胞实验研究.pdfVIP

Lentivirus介导表达多基因的人胚基因工程 神经干细胞实验研究 蔡培强1汤逊1林月秋1M．OUDEGA2B．BLITS3阳运康1徐林4周田华1 l成都军区昆明总医院骨科昆明650032 to ofMiamiSchoolofMedicine，Miami，FL33101，USA 2TheMiami Cure Project Paralysis，Univemity 3GraduateSchoolforNeurosciencesAmsterdam， InstituteforBrainResearch，Amsterdam，TheNetherlands Netherlands 4中国科学院昆明动物研究所 昆明650032 【摘要】目的：探索以Lentivirus为载体，构建同时携带并表达多基冈的基因工程人胚神经 Neuralstem 干细胞(Human cell，hNSC)的可行性，以便为脊髓损伤研究提供材料。方法： Fluorescence ①分离、培养和鉴定hNSC：②用携带绿色荧光蛋白(Green Protein，GFP)和 Root blot等方法检测基因工程hNSC的多基因表达。结果：①获得了大量 Ganglion，DRG)和Slot DRG旺盛生长；④Slotblot检测到基因工程HNSC能高效分泌NT一3蛋白。结论：成功构建了 同时携带并稳定表达多基因的基因工程hNSC，为脊髓损伤基础研究及进一步临床应用提供有价 值的细胞资源，具有，“阔应用前景。 【关键词1Lentivirus：人胚神经干细胞；基因工程；神经营养因子一3；绿色荧光蛋白 Cord SCI)后的再生修复一直是医学科学领域内的一大难题。一方面 脊髓损伤(SpinalInjury， 脊髓的原发性损伤及其继发的病理生理改变导致脊髓内功能细胞缺失；另一方面神经营养因子或诱导因 子不足，致使绝人部分轴突的再生努力归于失败，即所谓“夭折性再生”。因而如何改变SCI后不适宜 再生的微环境是研究和治疗SCI急需解决的问题。NSC是CNS中具有自我更新能力和多向分化潜能的细 胞， 能被大量扩增，并可在体内和体外诱导分化成CNS内3种主要的功能细胞：神经元、星形胶质细 胞、少突胶质细胞，是SCI后再生修复的理想材料和基因载体。因此，采用神经营养因子基冈修饰NSC 移植可能是最具前景的治疗方法之一。本文作者应用无血清培养技术从流产胎儿大脑皮层分离、培养 Blot等方法分别从形态学、生物学活性和蛋白水平检测 显微镜观察、鼠胚背根神经节培养及Sloting 了其转基因表达，为进一步基因工程hNSC治疗SCI的实验研究和临床研究提供基础资料。 l材料和方法 1．1主要试剂 的各种质粒由美国迈阿密大学Martin教授赠送。 1-2方法 1．2．1人胚神经干细胞的分离培养：在无菌条件下取孕2～3月流产胎儿皮层组织，放入PBS仔细分离 255 第四届全国解剖与临床学术研讨会暨‘解剖与临床》杂志创刊lO周年庆祝会论文汇编 然后用一光洁巴斯德管反复吹打组织，制成单细胞悬液，再用200目细胞筛过滤，去除大的组织块，转 105 ／ml接种于培养瓶中。14天传代一次，5～6天半量换液。用Nestin抗体染色鉴定hNSC。 1．2．2人胚神经干细胞的诱导分化：取适量培养的hNSC，置入装有经0．1％多聚赖氨酸处理过盖