一种与HBx蛋白相互作用未知蛋白抗体的制备及其应用.pdfVIP

维普资讯 第 51卷 第 6期 武汉大学学报 (理学版) Vo1．51NO．6 2005年 12月 J．W uhanUniv．(Nat．Sci．Ed．) Dec．2005，723～ 726 文章编号 ：1671—8836(2005)06—0723—04 一 种与HBx蛋白相互作用未知蛋白 抗体的制备及其应用 张建林，思 维，赵伟光，黄 静，朱 应，李 雁，章晓联，吴建 国 (武汉大学 生命科学学院／病毒学国家重点实验室，湖北 武汉 430072) 摘 要 ：本研究构建 UK蛋 白的原核表达载体 pET28一UK，转化 BI21宿主菌，经过 IPTG诱导、表达 、纯化，获 取 UK蛋 白，制备抗原，免疫杭州大耳 白兔．经过 3次免疫后心脏采血，吸取血清作为抗体．经过 ElISA和免疫荧光 试验验证，陔抗体町以识别机体 UK蛋白．本研究为深入阐明 HBx与UK蛋 白的相互作用的功能性试验，以及完 全阐明UK蛋 白在细胞 内的功能奠定了基础． 关 键 词 ：HBx蛋 白；UK蛋 白；抗体 ；应用 中图分类号：R373 文献标识码 ：A 后制备相应 的抗体．随后采用免疫荧光试验和 0 引 言 ELISA方法检测其特异性． 乙肝病毒 x(HBx)蛋 白不仅是病毒复制所必需 1 材料与方法 的，而且与 乙型肝炎和原发性肝癌 (hepatocellular carcinoma，HCC)的发生发展有密切 的关系 ．国 1．1 材料 内外的研究表明HBx蛋白是一种在 HBV致病 、致 UK基因 (Genbankaccession：NM 032709)购 癌过程 中起重要作用 的转录激活蛋白，可 以转录激 自ATCC．宿主菌 E．coliDH5d、BI21以及本研究 活多种信号蛋白和原癌基因表达，但是 HBx并不直 其他相关质粒载体均 由本室保存． 接与 DNA接触 ，而是通过蛋 白与蛋 白的相互作用 1．2 方法 发挥其功能的[3]．阐明HBx蛋白与其相互作用的细 1．2．1 UK蛋白表达载体的构建 胞蛋白的功能仍然是揭示 HBV致病 、致瘤 的分子 利用 Primer1：5 GACCCTTGGATCCGTG— 机制的基础．作者以前报道 了运用酵母双杂交系统 CAGGTGAACAGTGAAGGC 3，(下划线为限制 筛选到多种细胞蛋 白与 HBx蛋 白的相互作用[4]， 性内切酶 BamHI位点)和 Primer2：5，_GAGCAC 其中包括未知功能的肝细胞蛋 白UK，随后通过体 CTCGAG TTCAGGGGTGGAGTCTTCTTC 一3 ， 外免疫共沉淀得以验证．体内免疫共沉淀、免疫荧光 (下划线为限制性 内切酶 XhoI位点)以质粒 pOT— 共聚焦实验证实 HBx蛋 白可以在细胞内结合 UK UK为模板扩增 UK 基因3端编码 区，约 0．9kb． 蛋白，该研究结果将另文报道．生物信息学方法研究 PCR产物经过凝胶纯化和限制性内切酶BarnHI、 结果预示 UK蛋白在细胞分裂、细胞能量的产生和 XhoI消化处理后，再次经凝胶纯化，然后克隆到原