山羊不同成熟阶段卵母细胞玻璃化冷冻敏感性的探讨.pdfVIP

繁殖技术 2014年全国养羊生产与学术研讨会议论文集 201 山羊不同成熟阶段卵母细胞玻璃化冷冻敏感性的探讨 权国波1’2，3，马媛1,2,3倪艺娜1，2，3，李东江1，2，3，洪琼花1，2，3 (1．云南省畜牧兽医科学院，昆明650224；2．云南省肉羊工程技术研究中心，昆明650224； 3．云南省畜禽遗传资源保护和种质创新实验室，昆明650224) 摘要：试验比较了山羊GV期和MII期卵母细胞对玻璃化冷冻损伤敏感性的差异。卵巢取自昆明当地屠宰 场，将采集的GV期卵母细胞分成两组。第1组直接用于毒性实验和玻璃化冷冻保存；第Ⅱ组经体外成熟至 MII期后用于毒性实验和玻璃化冷冻。冷冻方法采用Cryoloop法。结果表明：毒性实验组和冷冻保存组卵母细 o毒性实验组GV期卵母细胞的形态正常率显著低 胞的形态正常率和发育率均显著低于新鲜对照组(尸之0．05 率之间差异不显著((8．51±1．46)％VS(12．41±3．74)％，P0．05o进一步表明，GV期未成熟卵母细胞对玻璃化冷 冻的敏感性要明显高于MII期成熟卵母细胞。 关键词：山羊；卵母细胞；玻璃化冷冻；冷冻敏感性 I期)对冷冻保存具有更好的抗 卵母细胞的冷冻保存对于家畜遗传资源保护和胚 熟卵母细胞(GV期或M 胎生物技术的开展具有非常重要的意义。然而，尽管已 冻能力【卅。但是在山羊方面尚未证实这一结论。本实验 经开展了多年的卵母细胞冷冻保存研究．但是卵母细 胞的冷冻保存效果要明显低于胚胎。目前，卵母细胞的 母细胞．探讨成熟阶段对山羊卵母细胞玻璃化冷冻保 冷冻保存已经成为低温生物学研究领域的一个难点。 存效果的影响。 与胚胎相比．卵母细胞的体积与表面积比值大，胞 1材料与方法 质相对丰富。对冷冻保护剂渗透性差，冷冻时不易充分 1．1卵母细胞及山羊卵巢 脱水；在胚胎冷冻过程中，一些细胞损伤死亡后，剩余 卵母细胞及山羊卵巢采自昆明当地屠宰场。用切 的细胞仍有可能修复进行正常的胚胎发育，但卵母细 com— 胞为单一细胞。无法进行冷冻后修复，损伤后难以存 活。目前，卵母细胞的冷冻保存研究主要集中于MII期 后。剔除卵巢表面的脂肪和结缔组织等。将卵巢移人盛 有抽卵液(PBS+36 000 成熟卵母细胞。然而。MII期卵母细胞的结构和生理特 mg／L丙酮酸钠+1mg／L葡萄糖+ 点决定其对低温或冷冻非常敏感。冷冻可以导致卵母 960 mg／L青霉素+50m涨霉素，pH=7．4)的培养皿中， 细胞的孤雌活化、皮质颗粒成熟前胞外分泌、透明带硬 用手术刀片切割卵巢表面直径2～5mlll的卵泡．在体视 化、减数分裂纺锤体和染色体损伤、质膜和微绒毛改变 显微镜下检卵。卵母细胞应满足以下标准：形态完整、 以及细胞内脂质分布变化等。此外，冷冻还可以破坏卵 细胞质致密、色泽均一、卵丘细胞在3层或3层以上。 母细胞线粒体的完整性。从而导致ATP生成下降，阻碍 1．2卵母细胞的体外成熟培养 卵母细胞的体外受精和后续发育过程【1I。 一些研究认为。由于缺少纺锤体等结构，GV期卵 丙酮酸钠+25annol／L谷氨酰胺+0．075U／mL尿促性腺 母细胞的冷冻耐受性可能要优于成熟卵母细胞[21。然而， EGF ng／mL 争议仍然存在。最近有关猪和牛卵母细胞玻璃化冷冻 保存的研究结果表明．成熟卵母细胞(MⅡ期)较未成培养箱中预先平衡2