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纳豆激酶研究进展 丁有学刘兰 (中国药品生物制品检定所生化室) 研究者们对纳豆激酶开展了广泛的研究，本文就纳豆激酶的理化特性、功能、作用机理及其基因工程研 究等方面进行了综述。 1．理化性质 21。在实际测定中，测得的分子量结果却因 纳豆激酶由275个氨基酸残基组成，理论分子量为27728DaI 的结果为35000Da[31，圆二色法测得的结果为27300Da。其pI值为8．6a：0．3。 纳豆激酶为一单链多肽，由275个氨基酸残基组成，氨基酸序列中含有8个赖氨酸残基，不含半胱氨酸 残基。与其它枯草杆菌蛋白酶具有极高的同源性【4．51：与枯草杆菌蛋白酶BPN7的同源性为86％，与枯草杆菌 蛋白酶DY和枯草杆菌蛋白酶Carlsberg也分别有70％Ff【172％的同源性。纳豆激酶的活性中心在 Asp32，His64和Ser221，与底物的结合部位在Serl25，Leul26和Glyl27处141。 2．纳豆激酶的溶栓作用及原理 2．1溶栓作用 纳豆激酶是目前发现的近200种具有口服溶纤作用的物质中最具潜力的溶纤蛋白酶。在体外试验中 可以看到纳豆激酶与纤维蛋白溶酶原共同作用可以明显的溶解纤维蛋白凝块。在以大鼠为对象的动物实 验中，经过静脉注射发现纳豆激酶的纤溶能力是血纤维蛋白溶酶(plasmm)的4倍以上[91。健康人口服纳豆 o】。因 激酶的实验表明。纳豆激酶可以明显缩短优球蛋白溶解时间、增／Jn血t栓溶解面积和血栓分解产物【l 此，纳豆激酶不仅可用于静脉注射，还有很好的口服效果。 2．2纳豆激酶的溶栓机理 研究表明纳豆激酶的作用机制主要有四种方式【11J：面刺激血管内皮细胞产生组织型纤溶酶原激活剂(t —PA)，t—PA将纤溶酶原激活为纤溶酶，溶解纤维蛋白，降解血栓；2将体内的尿激酶原激活为尿激酶，尿激 酶与t—PA一同激活纤溶酶原，溶解血栓；§降解和失活尿激酶和t—PA的抑制剂pAI—l，从而激活更多的尿 激酶和t—PA，促进血纤维蛋白溶解。4直接水解交联纤维蛋白，大大加强其溶栓功能。但对纤维蛋白原不 敏感，水鳃活性与t—PA基本相同，因此，该酶发挥溶纤作用时不水解血浆纤维蛋白原，不易引起出血。直接 和间接双重溶解纤维的功能使纳豆激酶具有极强的溶栓效果。 2．3底物特异性 以小分子肽为底物研究该酶的酰胺水解酶活性，发现纳豆激酸最敏感的底物是血浆纤溶酶底物 不起作用【11。这说明纳豆激酶有其特异的蛋白水解作用和识别位点。 3．活性测定 纳豆激酶活性测定方法是人们深入了解和研究该酶的前提和基础，目前常用的活性测定方法主要包 括以下几种： 3．1试管法 在硅化试管中依次加入咪唑缓冲液、纯化的纳豆激酶样品、凝血酶和纤维蛋白原，使之产生絮状物， NaOH溶 置38(2水浴温育30分钟，然后终止反应。经尼龙网过滤未溶解的纤维蛋白进行冲洗，再加0．2mol／L 液，在沸水中煮15分钟，冷却后用紫外分光光度计在280nm处测定其吸收度，根据公式计算其纤溶活性【12J。 235 3．2纤维蛋白平板法 取琼脂糖、血纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液按一定比例混合，制成人工血栓平板。将纳豆激酶样品点 样于平板上，37C恒温孵育，测溶解圈直径，计算面积。并以标准纳豆激酶或尿激酶或纤溶酶等作标准品对 照绘制标准曲线，从标准曲线上读取样品酶活性。其原理足以凝血酶和纤维蛋白原作用生成的交联纤维蛋 白为底物，酶活与溶解圈面积成线性关系，故可用溶解面积来表示纳豆激酶的溶纤维活性【131。该法简便直 观，但测定值易随恒温孵育时间变化而变化，样品中杂质对实验结果影响较大。 3．3纤维蛋白块溶解时间(CLT)法114I OC下，在小试管中依次加入凝血酶、巴比妥钠缓冲溶液、纳豆激酶样品溶液和纤维蛋白原，强烈搅拌， 置于37℃恒温水浴中。从纤维蛋白形成起开始计时，随着反应液混浊，有气泡上升到液面，至气泡不再冒出 时所用时间作为纤维蛋白溶解时间。以标准纳豆激酶或尿激酶或纤溶