单条松树萎蔫病病原线虫的快速鉴定.pdfVIP

第25卷增刊 中国食用菌 EDIBLEFUNGIOFCHINA161 单条松树萎蔫病病原线虫的快速鉴定 A of methodfortheIdentification Rapid Single Pine Nematode WoOd、vilt Pathogen 王扬，扬佩文，胡先奇，喻盛甫 (云南农业大学植物保护学院。昆明650201) 松材线虫PCR检测的一对引物BMl：(5。 由松材线虫(Bursaphelenchu$Ⅻh，捌甜)引 起的松树葵蔫病是一种毁灭性的森林病害，病原 松材线虫为我国对内对外的重要检疫对象。快速 准确鉴定病松木或橙木制品中的病原线虫种类是 1．3用于PCR检测的单条线虫DNA模板制备 松树蒌蔫病的诊断和检疫的关键技术。常规的形 在一块经高压灭菌并剪成2．4mm的方形定 态学鉴定方法有时很难特剐区分松材线虫和致病 量滤纸片上滴加2lIl单倍松材线虫检测剂(古有 力较弱的近缎种拟松材线虫(Bursaphe／enchus 1．25mM dNTP、各15脚的特异引物BXl、 mucrorum)，而且只能用成虫鉴定。基于上述原 BX2)，或单倍拟松材线虫检测荆(古有1．25mM 因，本文根据松材线虫和拟松材线虫的核糖体基 因序列差异，设计了—套免DNA提取的单条松材 加3ul双倍松树线虫检测剂(古有l筋mM 线虫、拟松材线虫快速PCR鉴定方法。鉴定结果 dNTP、各15“M的4条特异引物BXI、BX2、 不受线虫发育阶段限制。准确性高。 BMl和BM2)，晾干待用；在解剖镜下从线虫分 1材料与方法 离液中挑取—条线虫人预先滴在载玻片的双蒸水 1．1嵌试线虫 滴中清洗后，移至水滴外．待线虫虫体周围的水 接近完全干燥时，用镊子取一块已干燥的含线虫 将分离自江苏南京(】NJ)和广东东莞 检测试剂的滤纸片覆盖于线虫虫体上．镊子轻按 (GDG)的松材线虫种群．以及分离自贵州贵阳 搪纸片将线虫压破，将滤纸片移人装有15|11双燕 (GGy)和云南江川(YJC)的拟松材线虫种群 在显微镜下仔细观察确认。用消毒液消毒，移至 水的0．2ml薄壁管中95℃加热10min。冷却至室 长满灰葡萄孢(Botry出c／nerea)的PDA培养基 备液。 上。25℃繁殖10d左右．得到纯化的线虫。20mi 无菌水冲洗培养基将线虫洗下．获得的线虫悬浮 1．4 PCR扩增 渡过400目筛，并用无菌水冲洗2—3扶，再将筛 在单条线虫DNA模扳制备液中加入2．5Id舍 面上的线虫无菌水冲洗入培养皿中保存。 x 1．5—2．0mMMgcl2的10 PCRbu断．1U1她 1．2 PCg引物设计 酶。补双蒸水至25|