不同硫酸化肝素衍生物的制备及其结构和生物活性关系的研究.pdfVIP

中国资派生物技术与粉工程学术研讨会论丈集2·005 不同硫酸化肝素衍生物的制备及其结构与生物活性关系的研究 范学强，姬胜利.，崔慧斐，曹吉超，王凤山 (山东大学药学院生化与生物技术药物研究所，济南 250012) 肝素属于糖胺聚糖类生化药物，是一类在结构上不均一、聚合程度上高度分散的硫酸 多糖。近年来研究发现，肝素除了广泛用于抗血栓和抗凝血外，还具有明显的抗炎和抗肿 瘤转移作用，这些功能与肝素的硫酸基的含量和硫酸基的位置密切相关。 为研究肝素分子中硫酸基的含量和硫酸基的位置对其生物学功能的影响，本研究采用 不同的方法对未分级肝素 (Hep)进行选择性脱硫酸化和多硫酸化，制得2-0一脱硫酸化肝 素 (2DeSH),N-脱硫酸化一重乙酞化肝素 (NDeSAcH),6-0-脱硫酸化肝素 (6DeSH)和多硫 酸化肝素 ((PSH)，并分析了它们的结构特点和某些生物活性。 本研究取得的结果和结论有以下几个方面。 1采用不同方法制备2DeSH,NDeSAcH,6DeSH和PSH，并用正交试验设计，优化2DeSH 的制备工艺。得到的四种肝素衍生物用高效液相色谱 (HPLC)测得分子量没有显著变化: 有机硫酸根含量分别为:20%,19%,18%和38%;各衍生物经PAGE分析可以看出，Mr分布 范围与Hep相似，其中PSH的Mr偏大;各样品经醋酸纤维膜电泳分析显示，2DeSH,NDeSAcH 和6DeSH的迁移率明显增大，而PSH的迁移率明显减小:三种脱硫酸化肝素的抗凝及抗FXa 活性都显著降低，而PSH的抗凝活性降至原料的19%，而抗FXa活性降至80%，证明肝素 的抗FXa活性不依赖于其抗凝活性。 2通过对各样品的紫外([N)光谱、红外 I〔R)光谱及核磁共振光谱(13C-NMR,IH-NMR) 等的分析，确定了各个产品的主要分子结构特征。 3 通过大鼠腹腔被动MC脱颗粒实验，观察肝素及其衍生物对卵清蛋白引起MC脱颗 粒的影响。结果显示，PSH组的脱颗粒率为12.65%，其抑制活性最强，2DeSH组和NDeSAcH 组分别为19.13%和16.68%(P0.01，与阴性对照组比较)，而6DeSH组为36.54%(P0.01, 与阳性对照组比较)，这说明肝素对肥大细胞脱颗粒的抑制活性不仅仅与所带负电荷的多 少有关，还与肝素结构上硫酸基部位有关。其中6-0-硫酸基对肝素抑制肥大细胞脱颗粒活 性起关键作用、 4 用ELISA测定肝素及其衍生物对IL-4活性的影响。与HeP比较，NDeSAcH,2DeSH 和PSH对工L-4活性的抑制作用没有显著性差异，而6DeSH抑制率为47.57%，表现更强抑 制作用 (P0.05，与HeP组比较)。说明脱硫酸化和多硫酸化肝素仍然具有抑制IL-4活 性的能力，其中6-0-脱硫酸化后抑制能力增强。可以推测6-0-硫酸基的去除使肝素的构 象更有利于与IL-4的结合，从而抑制其活性。 5肝素及其衍生物对明胶酶活性的影响实验表明，低剂量时随着剂量的增大抑制活 性增强，并且都在相同的浓度出现抑制高峰。随后，随着剂量的增大抑制活性降低，甚至 在某一高的浓度出现促进作用。可以推测肝素对明胶酶的作用不仅与肝素的硫酸化程度有 关，还与肝素特定序列有关。肝素的某一寡糖序列起到结合明胶酶的作用，而硫酸根起到 影响活性强弱的作用。但是参与结合的寡糖序列还没有进行详细的结构分析。 关键词;肝素;脱硫酸化肝素;多硫酸化肝素;制备;抗炎;白细胞介素4;白细R} 介素5;肥大细胞:明胶酶 .通讯作者:姐胜利，email:shenglijilsdu.edu.cn,0531-8380288