人1抗胰蛋白酶活性检测(1AT)酶联免疫分析.docVIP

人α1抗胰蛋白酶活性检测(α1-AT)酶联免疫分析 试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用 产品编号：CSB-E11719h 检测范围： ng/ml -2000 ng/ml 最低检测限： ng/ml 特异性：本试剂盒可同时检测天然或重组的人α1-AT，且与其他相关蛋白无交叉反应。 有效期：6个月 预期应用：ELISA法定量测定人血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中α1-AT含量。 说明 1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。 2．浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。 3．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。 4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,α1-AT)主要是由肝细胞合成的一种丝氨酸蛋白酶抑制剂(serineproteaseinhibitor,serpin)，能抑制多种丝氨酸内切肽酶(serineendopeptidase)—弹性蛋白酶、胰蛋白酶、血浆素、凝血酶等蛋白酶的活性在电泳中其迁移位点位于α1蛋白带，因而又被称为α1-蛋白酶抑制剂(α1-proteaseinhibitor,α1-PI)。α1-AT具有较强的血管透通性，在肺组织中的浓度较其它serpins或α2-巨球蛋白的浓度高，而且对弹性蛋白酶的专一性更强，因而它更主要的生理功能在于抑制肺脏弹性蛋白酶的活性，保护肺部不受弹性蛋白酶的酶解损伤。α1-AT为单链糖蛋白，肽链由394个氨基酸残基组成，肽链中含有43个Asn/Asp残基，但仅在Asn46、Asn83、Asn247上连接有寡糖链，其中一个糖链为三叉寡糖链，另外两个双叉寡聚糖链，糖含量约为12%。正常人血浆中α1-AT含量为(2.90±0.45)g/L，体内半衰期为6。实验原理 用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗α1-AT抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗α1-AT抗体、HRP标记的，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的α1-AT呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。 试剂盒组成及试剂配制 酶联板(Assay plate )：一块（96孔）。 标准品（Standard）：2瓶(冻干品)。 样品稀释液(Sample Diluent)：1×20ml/瓶。 生物素标记抗体稀释液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶。 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液?（HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。 生物素标记抗体（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100） 辣根过氧化物酶标记亲和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100） 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。 浓洗涤液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 终止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。 需要而未提供的试剂和器材 标准规格酶标仪 高速离心机 电热恒温培养箱 干净的试管和Eppendof管 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器 6. 蒸馏水，容量瓶等 标本的采集及保存 血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟，取上清即可检测，-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 2 - 8°C 1000 g离心15分钟，或-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 细胞培养物上清或其它生物标本：1000g离心20分钟，取上清即可检测，-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。 标本的稀释原则： 首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。只有稀释至标准曲线的范围内，检测的结果才是准确的。稀释的过程中，应做好详细的记录。最后计算浓度时，稀释了“N”倍，标本的浓度应再乘以“N”。 标准品的稀释原则：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为00 ng/ml，做系列倍比稀释后，分别稀释 ng/ml， ng/ml，500 ng/ml，250 ng/ml，125 ng/ml，62.5 ng/ml，31.2 ng/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0 ng/ml，临用前15分钟内配制。 如配制0 ng/ml标准品：取0.5ml（不要少于0.5ml）00 ng/ml的上述标准品加入含0