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第7章蛋白质的分离、纯化和表征53523.ppt
蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性 碱/酸越大——pI 越大 pI通常在 6.0 左右 蛋白质的分子量 一般在一万至一百万道尔顿之间 1道尔顿=1×C12绝对质量/12 ≈1.66×10-27千克 (一)根据化学组成测定最小分子量 (二)SDS-PAGE测定相对分子质量 (三)凝胶过滤法测定相对分子质量 三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 (二)蛋白质的沉淀 Pr从胶体溶液中析出 Ⅰ可逆沉淀: 温和条件,改变溶液pH或Pr所带电荷 Pr结构和性质没有变化 适当条件下可重新溶解 ——非变性沉淀 pI沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等 不可逆沉淀 强烈沉淀条件 破坏Pr胶体溶液稳定性 也破坏Pr结构和性质 沉淀不能再重新溶解 ——变性沉淀 如加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐 和生物碱沉淀等 盐溶—盐析 等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀溶解—盐溶 原因? 盐析 向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出 原因? 五、蛋白质的分离纯化方法 (一)根据分子大小不同的纯化方法 1、透析和超过滤 (二)利用溶解度差别的纯化方法 1.等电点沉淀 调整溶液pH 不同蛋白在各自 pI处依次沉淀 2.盐溶和盐析 (三)根据电荷不同的分离方法—电泳 原理: 蛋白质在非等电点时所带总电荷不为0 分子大小不同,电场中移动速度也不同 (四)利用蛋白质选择性吸附的性质 羟磷石灰层析 疏水作用层析 (五)利用对配体的特异生物学 亲和力的纯化方法 六、蛋白质含量测定和纯度鉴定(略) 离子交换层析 亲和色谱颗粒 具有极强的专一性 第7章 蛋白质的分离纯化和表征 一、蛋白质的两性电离及等电点 二、蛋白质分子的大小 1、测定蛋白质中某一微量元素的含量 2、假设蛋白质中仅含一个铁原子 最低相对分子质量= 100* 55.8/铁的百分含量 蛋白质颗粒电泳时迁移率取决于: 所带电荷 分子量 分子形状 十二烷基磺酸钠 原态蛋白质 变性 ? 磺酸基 极性亲水 烷基 亲油(蛋白质疏水区) 迁移率与电荷和形状无关,仅取决于相对分子质量 巯基乙醇破坏二硫键 蛋白质混合样 凝凝胶法只适于球状蛋白分子测量 (一)胶体性质(colloidal system) 胶体溶液的特点: 分子直径在1-100 nm内 溶于水 不易聚集沉淀 大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液 蛋白质胶体溶液的稳定因素: 1.同种蛋白带同种电荷,相互排斥 2.水膜弹性 蛋白质溶液具有丁达尔效应、布朗运动以及不能通过半透膜等性质 Ⅱ 1.盐析法 加入中性盐脱去蛋白质的水化层,盐析一般不引起变性 分子在等电点时,相互吸引,聚合沉淀,加入少量盐离子后破坏了这种吸引力,使分子分散,溶于水中 盐溶 蛋白质脱去水化层而聚集沉淀 盐析((NH4)2SO4) 2.有机溶剂沉淀 脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用 3.等电点沉淀 4.重金属盐沉淀 与带负电荷蛋白质结成不溶性盐 5.生物碱试剂和某些酸类沉淀 与带正电荷蛋白质生成不溶性盐 6.加热变性沉淀 天然结构解体,疏水基外露, 破坏水化层及带电状态 四、蛋白质分离纯化的一般原则 总目标:增加制品纯度或比活 1.前处理:因动/植物/细菌而异 2.粗分级分离:采用盐析/等电点沉淀/有机溶剂分级分离等方法 3.细分级分离:采用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等 4.结晶 利用蛋白质分子不能透过半透膜将其 与小分子物质分开 半透膜为玻璃纸或纤维素材料 血液透析 小分子溶出 小分子被带出 透析机 透析液 加压 血液 2、密度梯度(区带)离心 60000~80000转/分 重力60万~80万倍 3、凝胶过滤 3.有机溶剂分级分离法 降低介电常数 争夺水化膜 等电聚焦电泳 双向电泳
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