工业菌种的选育及改进.ppt

（二）优良载体的选择 基因工程使用的载体分为克隆载体和表达载体。无论原核基因还是真核基因要在大肠杆菌中复制和表达，都必须将其与合适的表达载体连接后导入宿主细菌，才能表达成蛋白质。 2、表达载体 表达载体必须具备以下条件： 1）应具有很强的启动子，能被大肠杆菌的RNA聚合酶识别。 【启动子是指在一条DNA链内，在转录起始期间可以被RNA聚合酶识别并结合的一段DNA序列。转录起始位点通常在启动子序列内。】 2）应具有使启动子受到抑制的阻遏子，只有在受到诱导时才能进行转录。 因外源基因的高效表达往往会抑制宿主细胞的生长、增值，而阻遏子可使宿主细胞免除此不良影响。 例如可先使宿主细胞快速生长增值到相当量，再通过瞬时消除阻遏，使所表达的蛋白质在短时间内大量积累，同时也可减少表达产物的降解。 阻遏子的阻遏作用可以由物理（如温度）、化学（如IPTG、IAA等）因素进行调节，这样可人为地选择启动子启动转录mRNA的时机。 3）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列（核糖体结合序列）。 4）应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因。同时强终止子所产生的mRNA较为稳定。 诱导表达时，由于强启动子所致的高水平转录反过来会影响质粒DNA自身的复制，从而引起质粒的不稳定或脱质粒现象。因此在外源基因的下游安置强终止子可以克服由质粒转录引起的质粒不稳定。 【终止子：位于操纵子或基因编码区末端的一段DNA序列，在原核生物中，在转录部分末端的终止子常有一个反向重复序列和紧接着一小段U。】 3、载体的常见类型 根据受体细胞不同，目前具备上述条件的载体有如下： 1）原核受体细胞 入噬菌体 松弛型细菌质粒(E.coli pBR322) 2)真核受体细胞 在酵母方面，主要是2μ质粒， 在植物方面，主要是Ti质粒， 在动物方面，主要有SV40病毒。 （注：SV40病毒：猿猴病毒，为多瘤病毒属的病毒，诱发成纤维瘤） B、丝状真菌 丝状真菌也是重要的工业菌株，近年来已在30多种真菌中建立了DNA转化系统。其特点是： 有很强的蛋白质分泌能力， 能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和糖基化等。糖基化方式与高等真核生物相似。 丝状真菌（如曲霉等）又确认是安全菌株，并有成熟的发酵和后加工工艺。 2、影响目的基因在工程菌中表达的因素 1）影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 外源基因的表达产量与细胞浓度和每一个细胞平均表达产量是正相关的，要想获得最高产量，必须了解影响这两者的各种因素，如外源基因的拷贝数、基因表达效率、表达产物的稳定性和细胞代谢负荷等与表达产量的关系。 A、外源基因的拷贝数 一般来说细胞内基因拷贝数增加，基因表达产物的产量也会增加。克隆在高拷贝数表达载体上的外源基因，会因表达载体拷贝数的增加而增加，因此高拷贝数表达载体的使用，有利于提高外源基因的总体表达水平。 B、外源基因的表达效率 有许多因素都会不同程度地影响外源基因的表达效率，如启动子的强度、核糖体结合位点的有效性、SD序列和起始密码子ATG之间的距离、密码子的组成等。 a）启动子的强度 启动子是在转录水平上影响基因表达。转录的最大效率取决于启动子中碱基的组成，往往会因一个碱基的不同，启动子效率可能提高上千倍。也就是说启动子会有强弱之分。要获得高效表达需要选择强启动子。 由于真核基因启动子不能被大肠杆菌RNA聚合酶识别，因此必须将真核基因编码区连接在肠杆菌RNA聚合酶能够识别的强启动子控制下。 常用的强启动子有lac、trp、tac等，将外源基因插入这类强启动子的下游，可以增加基因的表达产量。 但是如果启动子太强，RNA聚合酶有时超过了终止信号，引起过度转录和杂蛋白的生成，对宿主细胞的正常生长和基因工程产物的纯化不利，同时影响载体的稳定性。所以一般在多克隆位点的下游要插入一段核糖体RNA的转录终止子（rrnB）。 b） SD序列和起始密码子ATG之间的距离 SD序列和起始密码子ATG之间的距离及序列对mRNA翻译成蛋白质的效率有明显影响，SD序列和起始密码子之间的距离过长或过短都会影响真核基因的表达。调整SD序列与起始密码子ATG的间距，改变附近核苷酸序列，可提高非融合蛋白的合成水平。 c）核糖体结合位点的有效性 大肠杆菌核糖体结合位点对真核基因在细菌中的高效表达也十分重要，所以必须增加核糖体