.分子生物学研究方法.ppt

* 分子信标是一种新型的发卡结构的寡核苷酸探针,是在样品PCR过程中因和样品DNA 杂交后而使自身荧光构象改变从而实现对SNP的检测(原理见图1) 。分子信标由称为“茎”(stem)和“环”(loop) 的两部分构成,茎部分是由寡核苷酸探针两端互补的序列形成的,又可称之为手臂,环则是探针的中间部分,其序列和待扩增的目的片段互补并含有要检测的SNP 位点。在手臂的两个末端分别通过共价的方式结合上一个荧光分子和一个荧光猝灭基团,这样当分子信标游离在溶液时,它以发卡结构存在,荧光分子与猝灭基团在空间距离上挨在一起,十分接近,荧光分子被猝灭,此时溶液无荧光信号。相反当分子信标和其完全互补的目的片段杂交时,其发卡结构被拉开而使荧光分子和荧光猝灭基团在空间上分开从而发射出荧光,其信号可提高900倍。研究表明这种发卡结构的探针在和目的片段杂交时的特异性很高,对于仅相差一个碱基的目的片段都能够区分,因此用于SNP位点的检测,同时我们可以对分子信标标记以不同的荧光信号,从而能够对多个样品的同时检测。由于分子信标是在样品PCR 过程中的退火时期和目的片段特异性杂交,释放荧光,某一循环或循环后的荧光量取决于那时形成的特异的PCR 产物,因此也用于PCR 产物产量的实时检测。 * DNA 聚合酶、APT 硫酸化酶(ATP sulfurylase) 、荧光素酶(luciferase) 和腺苷三磷酸双磷酸酶( apyrase) * * 3’RACE 是在反转录酶的作用下，以连有可以和polyA配对的oligo(dT)的锚定引物启始cDNA第一条链的合成。 用RNaseH 降解模板mRNA。 用通用锚定引物和基因片段内部特异引物进行PCR扩增得到目的3‘片段，并可用nest PCR的方法继续进行检测和扩增。 * * 5.5.2.?应用cDNA差示分析法克隆基因(1)应用mRNA差别显示技术分离克隆目的基因 根据表达特性的差异可将高等真核生物的基因分为两大类：一类叫做看家基因（house-keeping gene），另一类叫做发育调控基因（developmental regulated gene。 我们将不同基因在生物个体发育的不同阶段，或是在不同的组织或细胞中发生的按时间、空间进行有序表达的方式称为基因的差别表达（differential expression）。 1992年，美国波士顿Dena-Farber癌症研究所的两位科学家P. Liang和A. D. Pardee发明了一种叫做mRNA差别显示PCR（mRNA differential display）技术，简称DDRT-PCR。 * * DDRT-PCR的主要操作步骤如下： （1）从不同发育阶段或不同基因型的细胞群体中分离mRNA，并以3锚定引物作为反转录的引物，合成第一键cDNA； （2）用5随机引物和某个3端锚定引物对扩增第一链(掺入32P-dNTP)； Liang P和Pardee A根据Poly A序列起点前2个碱基除AA外只有12种可能性的特征，设计合成了12种下游引物，称3′-锚定引物，其通式为5-T11MN；同时为扩增出polyA上游500bp以内所有可能性的mRNA序列，在5′端又设计了20种10bp长的随机引物。这样构成的引物对进行PCR扩增能产生出20000条左右的DNA条带，其中每一条都代表一种特定mRNA种 * * （3）用DNA变性测序胶分离扩增产物，X光片曝光后检测差别条带；（4）回收特异性差别条带；（5）用同一引物对扩增已回收的DNA条带；（6）用Northern，Southern及测序法分析所得的条带；（7）以该DNA片段做探针，筛选全长cDNA或核基因。 * * (2)应用cDNA差示分析法（RDA）克隆基因 l）cDNA文库差示筛选法，这是一种直接分离组织或发育特异表达基因的方法，例如对于两种不同的组织细胞，先提取它们的poly(A)+mRNA，分别构建这两种组织的cDNA文库，然后以这些mRNA为模板，合成放射性标记的cDNA探针，再用这两种探针分别与一类cDNA文库的两套重复考贝杂交，跟两种探针都杂交的克隆是两种组织细胞中都表达的基因，而仅与一种探针杂交的克隆则是在一种组织细胞中特异表达的mRNA，再对这样的克隆进行测序比较和鉴定，就可分离到这种组织特异表达的基因。用这种方法已分离到许多根茎叶和生殖器官等特异表达的基因。 * * A.差式杂交或扣除杂交克隆技术 * * RDA法充分发挥了PCR以指数形式扩增双链DNA模板的特性，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异扩增了目的基因片段。 因为试验对象（Tester）和供试探针（Driver）在