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中国试剂网 2.4.67 等 电聚 焦 等电点聚焦就是在电泳槽中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质 即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH 梯度，当蛋白质放进此体系时，不同的 蛋白质即移动到或聚焦于与其等电点相当的 pH 位置上，电聚焦的优点是：有很 高的分辨率，可将等电点相差 0.01-0.02pH 单位的蛋白质分开；一般电泳由于受 扩散作用的影响，随着时间和所走的距离加长，区带越走越宽，而电聚焦能抵消 扩散作用，使区带越走越窄；由于这种电聚焦作用，不管样品加在什么部位，都 可聚焦到其电点，很稀的样品也可进行分离；可直接测出蛋白质的等电点，其精 确度可达 0.01pH 单位。电聚焦技术的缺点是：一是电聚焦要求用无盐溶液，而 在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀，二 是样品中的成分必需停留于其等电点， 不适用在等电点不溶或发生变性的蛋白质。 电聚焦技术要求有稳定的 pH 梯度，要求极防止对流和防止已分离区带再混 合的措施，其办法有三：密度梯度，聚丙烯酰胺凝胶和区带对流聚焦，以第一种 方法为常用。 一、基本原理 （1）人工 pH 梯度：在分离蛋白质时常用一个直立的性，以蔗糖密度梯度防止 对流。当两个不同 pH 的缓冲液互相扩散时，在其混合区间即形成 pH 梯度，称 为“人工 pH 梯度”。因为缓冲液是电解质，在电场中的它的离子移动会引起pH 梯度的改变，所以不稳定。 （2 ）天然 pH 梯度：这种梯度是由电流本身所引起并保持的，比较稳定，其形 成过程是，当电解硫酸钠的稀溶液时，在阳极聚焦硫酸而在阴极聚焦氢氧化钠。 若将一些两性电解质放入槽中，则它们在阳极的酸性介质中就会得到质子而带正 电，在阴极的碱性介质中则失掉质子而带负电，这样就会受其附近的电极所排斥 而向相反方向移动。设其中有一个酸性最强的两性电解质（甲），当它由阴极逐 渐接近阳极的硫酸时，就会失去电荷而停止运动，（甲）所在的位置就是它的等 中国试剂网 2.4.67 电点，另有一个等电点稍高于（甲）的物质（乙) ，当向阳极运动靠近（甲）时， 它不能超过（甲），因为那里低于它的等电点。于是（乙)将带正电荷而向阴极移 动，它只能排要（甲）的阴极侧。假如有很多两性电解质，它们就会按照等电点 由低到高的顺序依次排列，形成一个由阳极向阴极逐步升高的平稳的pH 梯度， 此梯度的进程取决于两性电解质的 pH 值，浓度和缓冲性质。防止对流的情况下， 只要电流稳定，这个 pH 梯度将保持不变。 （3 ）两性电解质互相分离的条件：上述经验甲乙两物质形成两个相邻的不同pH 的等电点层，因为在它们中间不能形成纯水层，所以它们不是完全分离开的，中 间部分互相扩散，互相粘连。要使两物质完全分开，中间必须有一个介于其间 pH 值的物质，例如，当甲乙两物质的 pH 值正好一个在 7 以下，一个在7 以上， 即可以分开，因为中间形成了纯水层（pH=7) ，这时水是作为一个两性电解质而 存在。 （4 ）蛋白质的电聚焦分离：蛋白质及多肽是两性电解质，它们比氨基酸更适于 电聚焦，因为它们在等电点附近仍有电荷而能进行电迁移，大部分中性氨基酸在 接近等电点时就失去电荷而停止运动，不能过到真正的等电点。但在没有第三种 居间的两性电解质存在时也不能将两种蛋白质完全分开，必须有很多不同 pH 值 的是电解质（载体两性电解质）才能解决这个问题。 二、载体两性电解质 （1）载体两性电解质必需具备的条件： （i ）在等电点处必需有足够的缓冲能力，以便能控制pH 梯度，而不致被样品蛋 白质或其他两性物质的缓冲能力改变pH 梯度的进程。 （ii ）在等电点必需的足够高电导，以便使一定的电流通过，而且要求具备不同 pH 值的载体有相同的电导系数，使整个体系中的电导均匀，如果有局部电导过 小，就会产生极大的电位降，从而其他部分电压就会太小，以致不能保持梯度， 也不能使应聚焦的成分进行电迁移，达到聚焦。 中国试剂网 2.4.67 （iii ）分子量要小，便于与被分离的高分子物质用透析或凝胶过滤法分开。 （iv ）化学组成应不同于被分离物质，不干