基因枪介导的pSilencercJun载体对大鼠结肠组织的RNA干扰效应.docVIP

基因枪介导的pSilencercJun载体对大鼠结肠组织的RNA干扰效应【关键词】? RNA干扰，基因枪，cJun，基因治疗 　　0 引言 　　RNAi要进入实际应用，迫切需要解决的问题是如何研制有效的给药系统将siRNA分子准确传送到靶组织. 基因枪技术已经在肿瘤基因疫苗研制方面得到了应用，并且成功地介导特异siRNA抑制肿瘤细胞生长［1］. 从而为联合应用RNAi干扰和基因枪技术对以cjun为靶点的基因治疗的实现提供了实验依据. 前期研究中pSilencercjun载体在COS7细胞中显示良好的基因沉默效率，我们将基因枪技术与RNAi技术结合起来，直接运用基因枪轰击大鼠结肠组织，将RNAi实验运用于活体组织，验证基因枪介导的活体动物基因沉默. 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　体质量200~250 g SPF级Wistar大鼠8只.质粒提取试剂购自上海生工，pSilencer载体购自Ambion, cJun, βactin抗体购自Santa cruz公司，二抗购自北京中杉金桥生物公司. 　　1.2 方法 　　1.2.1 基因枪及子弹制备SJ500手提基因枪购自宁波新芝公司，金粉由宁波新芝公司馈赠，子弹制备按亚精胺CaCl2包被法.?　　1.2.2 动物实验 　　大鼠手术开腹，选择其自肛门5~8 cm段结肠，按操作说明书用基因枪轰击大鼠cjun基因特异性pSilencer质粒，缝合关腹.轰击24 h后脱颈椎处死，剪取相应结肠组织. 　　1.2.3 Western Blot检测 　　大鼠结肠组织cJun蛋白的表达取大鼠的结肠组织0.5 g，剪碎加入细胞裂解液，匀浆裂解40 min ，12000 g/min离心5 min，收集上清液进行蛋白定量（考马斯亮蓝法）. 变性SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移，丽春红S染色，封闭非特异性的结合位点，TBST洗膜，然后加入抗cJun的mAb（1200）孵育2 h. TBST洗膜后加入结合有辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔的IgG二抗（14000）孵育2 h.. 化学发光、显影、定影，βactin蛋白作为内参照. 　　2 结果 　　Western Blot显示内参照βactin蛋白表达没有差异，pSilencercjun载体干预时cJun蛋白表达明显减少，载体剂量为9 μg以上时基本完全被抑制. 　　3 讨论 　　cJun蛋白可与原癌基因Fos家族的产物Fos蛋白形成异源二聚体—激活蛋白1(AP1). 且与其结合位点（佛波酯反应元件，TRE）特异序列高效率结合，诱导基因转录，导致炎症、肿瘤等多种疾病的发生. 由于cFos不具有DNA结合能力，只有与cJun结合后才能形成AP1［2］. RNA干扰现象自发现以来，已经应用脂质体、逆转录病毒、电穿孔等一些化学和物理的方法，将RNAi的效应分子siRNA转染入真核细胞中发挥作用［3］. 但是，是否能将稳定性差、组织靶向性低的siRNA分子正确导入生物活体内，一直是临床运用的最大问题. 基因枪技术可以将附着在大量金属微粒上的质粒，组成“基因子弹”后，在高压气体的驱动下打入组织进入细胞后发挥相应作用. 此技术具有迅速方便, 安全性高、对靶细胞要求低，基因用量少，无限制转移基因长度的特点. 　　本研究运用基因枪技术将特异性的pSilencerTM1.0U6cJun导入活体大鼠结肠组织抑制了cJun的表达. 结果显示当psilencer载体剂量9 μg以上时cjun的表达基本完全被抑制在(图1). 证明外源质粒可以诱导活体组织的RNA干扰,为致病基因和药物靶基因的筛选创造良好的条件，并为今后运用RNA干扰技术治疗炎症、肿瘤等结肠疾病奠定了基础.? 【参考文献】? 　　0 引言　　RNAi要进入实际应用，迫切需要解决的问题是如何研制有效的给药系统将siRNA分子准确传送到靶组织. 基因枪技术已经在肿瘤基因疫苗研制方面得到了应用，并且成功地介导特异siRNA抑制肿瘤细胞生长［1］. 从而为联合应用RNAi干扰和基因枪技术对以cjun为靶点的基因治疗的实现提供了实验依据. 前期研究中pSilencercjun载体在COS7细胞中显示良好的基因沉默效率，我们将基因枪技术与RNAi技术结合起来，直接运用基因枪轰击大鼠结肠组织，将RNAi实验运用于活体组织，验证基因枪介导的活体动物基因沉默. 　　1 材料和方法　　1.1 材料　　体质量200~250 g SPF级Wistar大鼠8只.质粒提取试剂购自上海生工，pSilencer载体购自Ambion, cJun, βactin抗体购自Santa cruz公司，二抗购自北京中杉金桥生物公司.　　1.2 方法　　1.2.1 基